中華鱉源粘質沙雷氏菌分離、鑒定及藥敏特性研究

楊移斌，艾曉輝，曹海鵬，楊先樂，姚嘉赟，沈錦玉

(1.中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢 430223； 2.農業部淡水漁業健康養殖重點實驗室，浙江省魚類健康與營養重點實驗室， 浙江省淡水水產研究所，浙江湖州 313001；3.上海海洋大學，上海 201306)

中華鱉(Trionyxsinensis)又名甲魚、水魚、團魚等，其分類地位為龜鱉目(Testudines)鱉科(Trionychidae)，鱉屬(Trionyx)。中華鱉野生種群在國內廣泛分布，同時也是國內重要淡水養殖品種，深受廣大消費者喜愛。由于市場需求不斷增大，國內養殖范圍不斷擴大，中華鱉養殖業在國內快速發展。但也因其養殖規模及集約化程度不斷提高，中華鱉養殖環境急劇惡化，病害頻發，尤其是細菌性病害常引起較大經濟損失。目前已經報道的中華鱉細菌性病原主要有嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[1]、溫和氣單胞菌(A.sobria)[2]、豚鼠氣單胞菌(A.caviae)[3]、遲緩愛德華菌(Edwardsiellatarda)[4]、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)[5]、格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)[6]、摩氏摩根菌(Morganellamorganii)[7]、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)[8]及蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)[9]。

2015年7-8月，湖北荊門某規?；B殖場中華鱉暴發大規模死亡。中華鱉發病死亡率高，但發病周期較長，引起了較大經濟損失。經臨床診斷及取樣，本研究在發病瀕死中華鱉體內分離到1株優勢菌，進行了人工感染及鑒定實驗，確定了分離菌株的種類，并對其藥物敏感特性進行了測定，以期為該病的有效防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗魚

具備典型癥狀的患病中華鱉10只取自湖北荊門中華鱉養殖場；感染用中華鱉(50±1.5) g購于湖北荊門中華鱉原種場，所購中華鱉體格健壯，無傷病，活力強，暫養于實驗室玻璃缸中7 d后無異常用于試驗。

1.1.2 試驗試劑

MH瓊脂、腦心浸出液培養基、營養瓊脂、營養肉湯、革蘭氏染色液、藥敏紙片及細菌微量生化管均購自杭州微生物試劑有限公司；PCR反應體系、細菌基因組DNA提取試劑盒均購自天根生化；測序服務及引物合成均由武漢擎科提供。

1.2 方法

1.2.1 臨床診斷

對中華鱉養殖場環境進行調查，統計中華鱉發病死亡率，確定病害主要危害對象規格；對發病死亡中華鱉進行臨床診斷，確定典型病癥，并通過光學顯微鏡鏡檢確定有無寄生蟲感染等，取具典型癥狀瀕死中華鱉回實驗室進一步分析。

1.2.2 病原菌分離

在無菌條件下，取患病中華鱉的肝臟、腎臟、脾臟及腹水劃線于BHI平板上，置于28 ℃恒溫培養箱中24 h，挑取形態、大小及顏色基本一致的菌落進行細菌再純化，獲得的細菌純培養物加入25%的甘油混勻后置于-80 ℃保存。分離菌株暫命名為HD01。

1.2.3 人工感染及LD50測定

人工感染 將分離菌株HD01劃線于腦心浸出液瓊脂培養基上，置于28 ℃恒溫培養箱中24 h，用無菌生理鹽水洗下菌苔，并參照麥氏比濁法調整菌懸液濃度為2.6×108CFU/mL。

將感染用中華鱉分為試驗組和對照組，每組均設置3個重復，每個重復30只中華鱉。連續充氧，水溫控制在26～29 ℃。實驗組中華鱉腹腔注射分離菌株菌液0.1 mL/尾，對照組相同部位注射等量無菌生理鹽水。每8 h觀察中華鱉活動狀況，及時記錄發病死亡中華鱉數量，并對死亡中華鱉進行解剖觀察，進行細菌再分離。

細菌LD50測定 將HD01株菌液稀釋成濃度為9.0×1010、9.0×109、9.0×108、9.0×107、9.0×106CFU/mL的菌懸液，分別注射到不同組中華鱉體內，每只中華鱉注射0.1 mL，相當于不同組每尾注射分離菌株HD01的劑量9.0×109、9.0×108、9.0×107、9.0×106、9.0×105CFU，進行攻毒實驗，對照組中華鱉相同部位注射等量無菌生理鹽水，每組中華鱉各30只。持續觀察試驗中華鱉的活動情況，及時記錄發病死亡數量，并用概率單位圖解法[10]計算半致死劑量(LD50)。

1.2.4 形態學及生理生化特性測定

將分離菌株在營養瓊脂平板上劃線，分別置于28 ℃及37 ℃恒溫培養24 h后，觀察菌落大小、形態特征及其顏色，并進行革蘭氏染色，采用細菌微量生化鑒定管參照《常見細菌系統鑒定手冊》[11]測定分離菌株生理生化指標。

1.2.5 16 S rRNA基因序列測定及系統發育分析

將菌株HD01接種于腦心浸出液培養基中，置于28 ℃震蕩培養24 h，高速離心后收集菌體，提取DNA作為PCR擴增反應模板。細菌16S rRNA序列擴增引物為27F：5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。參照董婷等[12]方法進行PCR反應擴增目的基因。擴增產物確定為目的片段后送武漢擎科生物公司純化及序列測定。

將測序結果放到美國國家生物技術信息中心基因庫中進行比對，根據比對結果下載同源性較高的序列采用Clustal X軟件進行多序列匹配分析，通過MEGA5.1軟件Neighbor-Joining法構建系統進化樹，1 000次Bootstrap檢驗置信度。

1.2.6 藥敏特性分析

分離菌株藥敏特性分析參照NCCLS抗微生物藥物敏感性實驗執行標準采用K-B法進行[13]。將分離菌株HD01接種于BHI液體培養基中，經28 ℃震蕩培養24 h，用無菌生理鹽水制成濃度為107CFU/mL的菌懸液，取200 μL菌液均勻涂于MH瓊脂平板上，貼上不同種類的藥敏紙片，置于28 ℃培養24 h后測量不同藥敏紙片的抑菌圈直徑。

2 結果

2.1 臨床診斷

發病養殖場規模較大，養殖面積達67 hm2，其中發病約占30%。池塘養殖的中華鱉發病率約20%，死亡率卻高達90%，從發病到死亡約1個月，周期較長，發病規格為400～600 g，引起較大經濟損失。經對養殖環境調查發現，其養殖用水氨氮在0.2～0.5 mg/L，亞硝酸鹽在0.02～0.06 mg/L，pH7.2，溶氧6.5～8.2 mg/L，水溫25～29 ℃；經鏡檢未發現寄生蟲，其典型癥狀主要為搖頭晃腦，離水上岸不久即死亡，解剖后腹腔有大量腹水，重要組織器官如腎臟等有充血，肝腎脾腫大，肝臟鮮紅色，脾臟發紫，腎臟發黑，腸道無明顯病變，但無食物。

2.2 細菌分離

從患病中華鱉肝、腎、脾及腹水中分離到一株優勢菌HD01。經人工回歸感染實驗，注射濃度為2.6×108CFU/mL HDO1的實驗組中華鱉死亡26.67%，而對照組未出現異常。感染發病死亡中華鱉與自然發病的中華鱉病癥基本一致，經細菌再分離實驗獲得了與菌株HD01形態及理化特征一致的菌株，表明分離菌株HD01是本養殖場中華鱉的病原菌。根據表1建立實驗魚死亡率(%)與細菌劑量對數[lg(CFU)]的關系曲線：y=0.25x-1.587 5(圖1)，分離菌株HD01對中華鱉半數致死劑量LD50=2.24×108CFU/尾，即4.48×106CFU/g。

表1 分離株對中華鱉LD50試驗結果Tab.1 Results of LD50 of isolation strain in T.sinensis

圖1 中華鱉死亡率(%)與細菌劑量對數 [lg (CFU)]的關系曲線Fig.1 The relation curve of T.sinensis mortality with logarithm of bacteria dose

2.3 細菌鑒定

經培養發現，分離菌株HD01在28 ℃條件下，在營養瓊脂培養基上呈現鮮紅色，而在37 ℃條件下呈現無色，而其形態大小均無明顯不同。分離菌株HD01為革蘭氏陰性菌，具體生理生化指標見表2，生理生化指標初步確定菌株HD01為粘質沙雷氏菌。將分離菌株HD01的16S rRNA基因序列與基因庫中已有序列進行比對，結果顯示HD01株與沙雷菌屬種類同源性最高，選取同源性高的沙雷菌屬序列及水產常見病原菌的16S RNA系列，構建系統發育樹(圖2)，結果顯示分離菌株HD01與粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)聚為一支，同源性最高，為99%。因此綜合生理生化特性判定HD01株為粘質沙雷氏菌。

表2 菌株HD01的生理生化試驗結果Tab.2 Results of biochemical characteristics of strain HD01

注：“+”：陽性；“-”：陰性；“(+)”：陽性反應超過24 h，“(-)”：陰性反應超過24 h；“d”：11%～89%菌株為陽性。

圖2 HD01株 16S rRNA 基因序列與相關菌株的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of HD01 16S rRNA gene sequence and its relatives

2.4 藥敏特性

藥敏實驗結果(表3)顯示分離菌株HD01對氟苯尼考、多西環素、慶大霉素、苯唑西林、磺胺異惡唑及氯霉素等14種抗生素高度敏感；對阿莫西林中度敏感；對青霉素、頭孢拉定及痢特靈等7種抗生素耐藥。

3 討論

3.1 粘質沙雷氏菌的鑒定

粘質沙雷氏菌隸屬于變形菌門(Proteobacteria)腸桿菌目(Saccharomycetales)腸桿菌科(Enterobacteriaceae)沙雷氏菌屬(Serratia)，是革蘭氏陰性桿菌[14]。本研究通過革蘭氏染色，形態學觀察及微量生化鑒定管測定分離菌株HD01，結果顯示HD01為革蘭氏陰性桿菌，生化特征與粘質沙雷氏菌一致，并且在28 ℃培養產生紅色色素，而在37 ℃培養則不產生[15]，亦符合粘質沙雷氏菌的基本特性。

注：S：高度敏感； I：中度敏感；R：耐藥。

細菌的16S rRNA 基因片段保守性很高，其片段長度約1 500 bp，但也存在相對變異區，即在不同科屬種間存在一定的變異[16]，通過測定菌株16S rRNA能快速、準確、高效區分不同菌株，目前16S rRNA基因序列分析成為微生物鑒定的良好工具[17]。通過對分離菌株HD01的16S rRNA序列進行測序，在NCBI中進行比對后，并構建系統發育樹，分離菌株與粘質沙雷氏菌聚為一支，同源性達99%。因此綜合形態學、生理生化特性測定及16S rRNA系列分析，判定分離菌株HD01為粘質沙雷氏菌，鑒定結果科學、準確、高效。

3.2 粘質沙雷氏菌的危害

粘質沙雷氏菌在自然環境廣泛存在，是水和土壤中的正常種群[18]，但大量研究證實，其也是臨床上的條件致病菌。目前已經報道粘質沙雷氏菌對多種昆蟲具備一定的致病性，如對棉鈴蟲、菜青蟲、蝗蟲、黃曲條跳甲幼蟲和成蟲、甜菜夜蛾等[18]，另外粘質沙雷氏菌還能引起家蠶的大規模死亡[14]；在人體免疫機能下降時，粘質沙雷氏菌會引起肺炎、關節炎、尿道感染、水型腸胃炎，甚至暴發敗血癥等嚴重疾病[19-21]。而關于粘質沙雷氏菌對水生動物致病報道相對較少，僅Cao等[22]報道了其引起西伯利亞鱘出現紅嘴病，導致西伯利亞鱘出現死亡。而本研究中中華鱉感染粘質沙雷氏菌導致搖頭晃腦及重要器官嚴重充血，與西伯利亞鱘發病癥狀有類似處。經回歸感染，試驗組中華鱉出現與自然發病相同癥狀，粘質沙雷氏菌對中華鱉半致死劑量LD50=4.48×106CFU/g，表明粘質沙雷氏菌是中華鱉的病原菌。

3.3 中華鱉粘質沙雷氏菌病的藥物防治

本研究測定了分離菌株HD01對22種抗生素的敏感性，實驗結果顯示，菌株HD01對氟苯尼考、多西環素、慶大霉素、苯唑西林、磺胺異惡唑及氯霉素等14種抗生素高度敏感；對阿莫西林中度敏感；對青霉素、頭孢拉定及痢特靈等7種抗生素耐藥。藥敏實驗結果與Cao等[22]研究有差異，可能是因為菌株來源、地理環境及用藥情況等不同造成的。經挑選高度敏感藥物氟苯尼考，參考水產用商品藥說明書使用，配合黃芪多糖伴餌投喂3 d后停止死亡，一個療程7 d后中華鱉恢復正常，不再出現異?；顒觽€體，取得了很好的治療效果。

雖然目前在水生動物病害治療時，藥物主要是抗生素治療仍然是首選有效手段之一，但細菌病害頻發，藥物濫用不僅導致病害防控失敗，也易引起環境問題，故研制高效預防技術如免疫防治等勢在必行。

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