150種中草藥體外抑殺維氏氣單胞菌的藥效研究

朱成科，王 建，周 燕，雷 駱，鄧星星，蒲德成，鄭宗林，周朝偉，鄭永華

(1.西南大學榮昌校區水產系，淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室， 水產科學重慶市市級重點實驗室，重慶 402460；2.巫溪縣農業委員會，重慶 405899； 3.西南大學動物科技學院，重慶 400716)

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)隸屬于氣單胞菌科(Aeromondaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)的一種條件致病菌，廣泛存在于淡水、海水、淤泥和土壤中[1]，在繁殖過程中產生黏附素、細胞毒素、腸毒素、氣溶素和溶血素等毒力因子，對水產動物、畜禽和人都有較高的致病性，為一種典型的人—獸—魚共患病病原菌[2]。常引起蝦、蟹、蚌、魚、蛙和鱉等水生生物細菌性敗血癥、體表出血、腐皮病、爛尾病等多種疾病[3-5]，該菌引發的疾病具有發病快、死亡率高的特點，給水產養殖帶來巨大的損失。

目前，盡管已有維氏氣單胞菌滅活疫苗研究報道，但受病原菌血清型、免疫方式、魚體自身特點等因素制約，致使免疫效果較差或不穩定[6,7]。因此，現在對于水產養殖動物細菌性疾病大多仍采用抗生素和合成藥物來控制其發生和流行[8]，然而大量、長期使用容易導致病原菌出現耐藥性增強，同時對水生態環境以及藥物殘留引起的水產品質量安全等負面影響備受人們關注[9]。所以急需尋找一種安全高效的新型水產藥物用于維氏氣單胞菌病的防治。

中草藥種類豐富，分布廣泛，在治療人類和動物疾病方面具有悠久的歷史，抑殺菌效果明顯[10]。與抗生素相比，中草藥具有無殘留、無抗藥性、毒副作用弱、對環境不易造成污染的特點[11]，同時，中草藥還具有免疫調節、補充營養和提高生產性能等作用，符合綠色健康養殖的要求[3,12]。選取150種具有廣譜抗菌活性的中草藥，研究其提取物對維氏氣單胞菌的體外抑菌作用，以期在實踐中篩選出對其體外抑制作用較好的中草藥，為該菌引起的水產動物疾病提供科學用藥的依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試維氏氣單胞菌株RC110724(登錄號：KC663719)由西南大學榮昌校區水產系魚類繁育與健康養殖研究中心從患病黃顙魚的肝、脾等內臟組織中分離、鑒定[1]，于4 ℃冰箱保存備用；150種中草藥(表1)均購買于重慶市榮昌區東風大藥房。

試驗用普通肉湯液體培養基配方為：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，水1 000 mL，pH值調至7.2～7.4，121℃滅菌15 min。固體培養基為每1000 mL液體培養基加入15 g瓊脂粉。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌液制備

將維氏氣單胞菌菌株RC110724接種于液體培養基中，28 ℃震蕩(200 r/min)培養4～6 h，取200 μL菌液均勻涂布于固體培養基，28 ℃培養4 h，在藥效試驗開始前，無菌蒸餾水洗下菌苔，采用麥氏比濁法將菌液濃度稀釋至1×107CFU/mL，待用。

1.2.2 中草藥藥液的制備

150種中草藥除大蒜外放入60 ℃干燥6 h后各取20.0 g，以400 mL蒸餾水浸泡2 h后煎煮，煮沸后文火煎煮30 min，4層紗布過濾，殘渣再加入300 mL蒸餾水，煎煮2次，合并所得藥液，濃縮至20 mL，使其終濃度為1.0 g/mL，調pH值至中性附近。121 ℃濕熱滅菌15 min，4 ℃保存待用。大蒜提取如下：挑選完好的蒜瓣，去皮，按質量1:1加入蒸餾水，研磨成漿，100目篩絹網過濾，4 000 r/min離心5 min，取上清液保存于4 ℃冰箱中，當天用[13]。

1.2.3 藥物體外抑菌試驗

采用瓊脂擴散法[14]測定。取稀釋后的菌液200 μL均勻涂布于普通瓊脂平皿(直徑為9 cm)上，待菌液干后，用直徑6 mm的滅菌打孔器在平皿上打4個孔，其中3孔加入50 μL藥液，另一孔以滅菌蒸餾水為陰性對照。置于28 ℃培養，培養24 h后觀察并測量抑菌圈直徑的大小。參照文獻[15]將中藥劃分成4個等級，分別為：抑菌圈直徑大于20 mm為抑菌作用強，用“+++”表示；直徑15～20 mm為中等強度抑菌作用，用“++”表示；10～15 mm表示抑菌作用弱，用“+”表示；小于10 mm為無抑菌作用，用“-”表示。

1.2.4 最低抑菌濃度(MIC)的測定

用二倍稀釋法測定各藥物的最低抑菌濃度(MIC)[11,16]。在超凈工作臺內，將中草藥提取液加入無菌普通肉湯液體培養基中，至使中草藥提取液終濃度分別為：1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49、0 mg/mL，然后吸取上述各濃度梯度普通肉湯培養基2 mL于10 mL滅菌試管中，在每個試管中加入20 μL維氏氣單胞菌菌液至終濃度為1.0×105CFU/mL。置于28 ℃、150 r/min恒溫搖床中培養24 h。然后觀察結果，清澈透明無渾濁現象的試管即為無菌生長管，無菌生長管中的最低藥物濃度就是最小抑菌濃度(MIC)，每種藥物重復3次。

1.2.5 最低殺菌濃度(MBC)的測定

在MIC試驗基礎上，把無菌生長的各管搖動均勻，繼續培養24 h，觀察結果，清澈透明無渾濁的無菌生長管中的最低藥物濃度為最小殺菌濃度(MBC)。并進一步驗證試驗，分別吸取該管及上一濃度梯度管的培養液0.1 mL，涂布于相應的瓊脂培養基上，28 ℃培養24 h，觀察是否有菌生長，最小殺菌濃度管無菌落形成則表明前面判斷正確，否則有誤，需重新開展試驗[17]。

2 結果與分析

2.1 150種中草藥提取液的抑菌效果

150種中草藥對維氏氣單胞菌的體外抑菌活性試驗結果見表1。對維氏氣單胞菌作用強(+++)的中草藥有五倍子、石榴皮、地榆和烏梅，抑菌圈直徑分別為(20.89±0.31)mm、(20.82±0.48)mm、(20.65±0.51)mm和(20.08±0.05)mm。中等強度抑菌作用(++)的有虎杖、黃柏、香薷等16種中草藥，抑菌直徑為15～20 mm。木瓜、萹蓄、桉樹葉等34種中草藥提取液表現出弱抑菌作用(+)，抑菌直徑為10～15 mm。海風藤、柴胡、茵陳等96種中草藥提取物不敏感，抑菌直徑均小于10 mm。

表1 中草藥提取液對維氏氣單胞菌的抑菌效果Tab.1 Antibacterial effect of Chinese herbal medicines on A.veronii

續表1

續表1

注：“+++”表示抑菌作用強，“++”表示抑菌作用中等，“+”表示抑菌作用弱，“-”表示無抑菌作用

2.2 MIC和MBC的測定結果

選取抑菌圈直徑大于10 mm的中草藥采用二倍稀釋法測定藥物對維氏氣單胞菌的MIC和MBC，試驗結果見表2。五倍子、地榆、石榴皮、烏梅、虎杖和訶子MIC和MBC均小于10 mg/mL，其中，五倍子抑菌作用和殺菌作用最強，MIC和MBC均為1.95 mg/mL，其次為地榆，其MIC為1.95 mg/mL，MBC為3.91 mg/mL；五味子、仙鶴草、香薷等13種中草藥具有較強的抑菌作用和殺菌作用，MIC和MBC介于15.63 ～62.50 mg/mL之間；艾葉、香加皮、女貞子等18種中草藥具有一定的抑菌作用和殺菌作用，MIC和MBC在125.00 ～250.00 mg/mL之間；劉寄奴、秦皮、穿心蓮等17種中草藥沒有表現出明顯的抑菌作用和殺菌作用，MIC和MBC均大于250 mg/mL。

表2 中草藥提取液對維氏氣單胞菌的最低抑菌濃度和最小殺菌濃度Tab.2 MIC and MBC of Chinese herbal medicines on A.veronii mg/mL

續表2

3 結論

采用打孔法(瓊脂擴散法)和二倍稀釋法從150種常見具有抗菌、清熱解毒特性的中草藥中篩選出五倍子、地榆、石榴皮、烏梅、虎杖和訶子對維氏氣單胞菌表現出了明顯的體外抑菌和殺菌活性，MIC和MBC均小于10 mg/mL，表明五倍子等6種中草藥對預防和治療由維氏氣單胞菌引起的水產動物疾病具有良好的應用前景。

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