SDBS對大鱗副泥鰍胚胎發育及幼魚性腺發育的影響

葉遼遼，徐 勝，袁秋蕓，陳平法，溫安祥

(四川農業大學生命科學學院，四川雅安 625000)

十二烷基苯磺酸鈉(Sodium dodecyl benzene sulfonate，SDBS)是一種陰離子表面活性劑，易溶于水，具有強力去污、濕潤、發泡等功能，被廣泛用于農業、醫藥和日用化工等多種領域。雖有研究表明SDBS具有良好的生物降解性，但水體環境復雜多樣，SDBS的微生物降解受到環境因素的影響很大，因而仍有SDBS殘留[1,2]。譚渝云等[3]研究發現SDBS能通過鰓吸收或食物鏈富集于魚體。過量的表面活性劑釋放到環境中會對人體健康產生眾多的負面影響，如腹瀉、消瘦、皮膚過敏、壞死以及呼吸問題等[4]，且SDBS還可對雄性小鼠和果蠅的生育能力產生顯著影響[5-7]。因鰍類獨特的生物學特性和對某些污染物或藥物的敏感性而成為理想的實驗材料[8-10]。本實驗擬通過孵化實驗和飼養實驗分別考察不同濃度SDBS與大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)胚胎發育及幼魚性腺發育的關系，以期為進一步探明SDBS對水生動物的影響提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SDBS購自成都市科龍化工試劑廠。參照于淑池等[11]的泥鰍毒性實驗方法，設計了0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 mg/L 6個SDBS濃度梯度進行預備實驗，確定SDBS濃度梯度為0、0.1、0.3、0.5、1.0、2.5、5.0 mg/L。大鱗副泥鰍親鰍(雄鰍2尾、雌鰍4尾)由四川農業大學動物學實踐教學基地提供。用LRH-A2(寧波市三生藥業有限公司)和DOM(寧波第二激素廠)催產，獲取受精卵用于胚胎發育實驗。70日齡大鱗副泥鰍購于四川省眉山市“麥綠漁業有限公司”，用于幼魚性腺發育實驗。

1.2 SDBS對大鱗副泥鰍胚胎發育的影響

將受精卵隨機分成7組，每組設3個重復，每個重復1 000粒，分組置于0、0.1、0.3、0.5、1.0、2.5、5.0 mg/L SDBS溶液中充氧孵化。受精10 h后，每2 h觀察一次孵化情況，直至孵化結束。統計培育周期、孵化周期、孵化率和畸形率(培育周期[12]指同時受精的一批卵中從受精到50% 孵化出膜時所用的時間；孵化周期指同時受精的一批魚卵從第一尾仔魚孵出至最后一尾仔魚孵化出時間間隔；孵化率=成形的仔魚/受精卵數×100%；畸形率=畸形仔魚數/成形仔魚數×100%)。

1.3 SDBS對大鱗副泥鰍幼魚性腺發育的影響

參照史改花等[13]對大鱗副泥鰍性腺分化的研究，選取70日齡性腺分化完全,體重3 g左右的健康大鱗副泥鰍210尾，隨機分成7組，每組設3個重復，每個重復10尾(據大鱗副泥鰍胸鰭形狀判斷性別，雌雄各5尾)，分組置于0、0.1、0.3、0.5、1.0、2.5、5.0 mg/L SDBS溶液中。根據SDBS降解速率[14]，每日全部更換一次玻璃魚缸中SDBS配制液。處理60 d后，統計各組大鱗副泥鰍的死亡情況，從每個濃度的各平行組中取雌雄鰍各3尾，制作性腺組織切片(5.0 mg/L濃度組死亡較多，將剩余大鱗副泥鰍全部制作切片)，H.E染色觀察。

1.4 數據處理

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，數據用平均數±標準差表示。組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著。采用概率單位法計算半致死濃度LC50。

2 結果與分析

2.1 SDBS處理后大鱗副泥鰍受精卵孵化情況

SDBS≤1.0 mg/L時，各濃度組大鱗副泥鰍受精卵的培育周期、孵化周期、孵化率和畸形率與對照組均無顯著差異。2.5 mg/L和5.0 mg/L濃度組的培育周期和孵化周期均顯著高于對照組，孵化率分別為69.18%和12.02%，遠低于對照組94.46%；鰍苗畸形率分別為4.23%和7.62%，是對照組的3～5倍，且2.5 mg/L與5.0 mg/L SDBS組之間大鱗副泥鰍的孵化率和鰍苗畸形率也存在顯著差異。此外，5.0 mg/L SDBS中部分受精卵有明顯的破裂現象。根據概率單位法計算，SDBS對大鱗副泥鰍受精卵的半致死濃度2d-LC50為2.935 mg/L。

表1 不同濃度SDBS對大鱗副泥鰍受精卵孵化的影響

注：使用LSD方法進行單因素方差分析，同列數據右肩標注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 SDBS處理60 d大鱗副泥鰍的死亡情況

0.3、0.5、1.0、2.5 mg/L SDBS組中大鱗副泥鰍相繼出現不同程度的細菌性腸炎、出血等疾病，造成大鱗副泥鰍死亡。5.0 mg/L SDBS組中大鱗副泥鰍未發現染病現象，但仍有大量大鱗副泥鰍死亡，死亡個體腹部膨大，鰓和肛門出血，身體表面有大量粘液，與于淑池等[11]的急性毒性實驗中毒癥狀一致。大鱗副泥鰍死亡情況趨勢線符合三次回歸式拋物線(R2> 0.9)。對回歸曲線進行F檢驗[15]，顯著性水平(P=0.007)小于0.05，說明60 d內大鱗副泥鰍的死亡率與SDBS濃度存在顯著相關性。根據概率單位法計算，SDBS對大鱗副泥鰍60 d的半致死濃度60 d-LC50為3.615 mg/L。

圖1 SDBS處理60 d大鱗副泥鰍的死亡情況

2.3 性腺的組織學觀察

2.3.1 SDBS處理60 d精巢的組織學觀察

從圖2可見，70日齡大鱗副泥鰍經60 d飼養，精巢已處于第Ⅴ時期。各實驗組(B～D組)精小葉分布絮亂，形狀不規則且小葉邊界模糊，較對照組(A組)體積小，數量多，成熟度不均一，次級精母細胞較多。各實驗組精巢小囊壁破裂，小葉腔中幾乎充滿成熟精子，只有靠近小葉腔壁處略有空隙。對照組精小葉體積較大，小葉間間介組織較薄，小葉邊界明顯，成熟精子較多，緊密排列在精小葉中。顯示SDBS明顯抑制了大鱗副泥鰍精巢的發育。

圖2 SDBS處理60 d的精巢

2.3.2 SDBS處理60 d卵巢的組織學觀察

各組大鱗副泥鰍卵巢中均存在第Ⅱ時相至第Ⅴ時相的卵母細胞，且各時相卵母細胞在數量和組織學形態上與對照組均無明顯差別(圖3)。可見，在本實驗濃度下SDBS處理60 d對大鱗副泥鰍卵巢發育沒有顯著影響。

圖3 SDBS處理60 d的卵巢

3 討論

3.1 SDBS對大鱗副泥鰍受精卵孵化的影響

SDBS對大鱗副泥鰍受精卵半致死濃度2 d-LC50為2.935 mg/L，小于尹伊偉[16]等測得SDBS對草魚受精卵半致死濃度(96 h-LC50為4.2 mg/L)，可能與魚的種類和實驗水溫等因素有關。SDBS濃度≥2.5 mg/L時顯著影響了大鱗副泥鰍的胚胎發育，致使其培育周期和孵化周期延長，孵化率下降，鰍苗畸形率上升。據張博文[17]研究，SDBS可抑制人宮頸癌細胞和中華倉鼠卵巢細胞的增殖。抑制細胞分裂的原因可能是SDBS插入膜脂，與膜脂或膜蛋白的跨膜結構域等疏水部分結合，破壞了膜結構[18]。此外，SDBS能夠抑制機體的抗氧化作用，使體內活性氧增多，可對DNA造成一定的損傷[19]，影響DNA表達，進而影響受精卵的分裂。

3.2 SDBS對大鱗副泥鰍死亡率的影響

已有研究表明，SDBS可有效減少魚體中NBT陽性細胞數量，降低SOD、IgM水平，使機體抗菌能力下降[20-22]。本實驗中0.3～2.5 mg/L SDBS濃度組的大鱗副泥鰍主要因感染細菌性腸炎等疾病而死亡，分析是SDBS降低了大鱗副泥鰍的抗菌能力所致。但5.0 mg/L SDBS濃度組大鱗副泥鰍未感染細菌性腸炎等疾病，可能是高濃度SDBS抑制了細菌生長[23]。至于該濃度組中大鱗副泥鰍死亡率更高，推測是SDBS通過鰓和皮膚進入魚體，富集于鰓、血液、腎、膽囊、性腺和肝胰臟等組織器官中的量更大[3,24]，導致其中毒死亡。

3.3 SDBS對大鱗副泥鰍幼魚性腺發育的影響

解剖時發現，1.0、2.5、5.0 mg/L SDBS組中大鱗副泥鰍精巢腫大，被膜緊張，有環狀隆起，水腫現象明顯，無法使用性腺成熟系數來評價大鱗副泥鰍性腺發育情況。觀察精巢組織切片時，發現所有實驗組大鱗副泥鰍精巢的結構遭到損壞，與韓俊娟等[5]對雄性小鼠的研究結論一致，推測可能是大鱗副泥鰍體內的ACP含量增高及ALP的活力下降所引起。ACP是溶酶體中一種重要的水解酶，其含量的升高可導致細胞壞死，ALP與包括性腺成熟在內的多種代謝有關，其活力的降低可引起魚類嚴重的生殖功能障礙[25]。卵巢的組織學觀察表明，各實驗組卵巢與對照組相比均無明顯差異。至于SDBS對大鱗副泥鰍雌雄性腺發育影響不同的原因尚不清楚，需進一步研究。

4 結論

SDBS濃度≥2.5 mg/L時，大鱗副泥鰍受精卵的培育周期和孵化周期延長，孵化率下降，鰍苗畸形率上升；大鱗副泥鰍死亡率隨SDBS濃度增加而升高，60 d的半致死濃度為3.615 mg/L；SDBS濃度≥0.1 mg/L時能抑制精巢發育。

[1]袁平夫,廖柏寒,盧 明.表面活性劑(LAS&NIS)的環境安全性評價[J].安全與環境工程,2004,11(3):31-34.

[2]陳慶華.合成型陰離子表面活性劑在水土環境中的降解[D].重慶：西南大學,2006.

[3]譚渝云,張甬元.14C標志直鏈烷基苯磺酸鈉在魚體內的積累,分布和釋放[J].中國環境科學,1991,11(2):125-129.

[4]Valizadeh S,Younesi H,Bahramifar N.Highly mesoporous K2CO3and KOH/activated carbon for SDBS removal from water samples:Batch and fixed-bed column adsorption process[J].Environ Nanotech Monit Manag,2016,6:1-13.

[5]韓俊娟,任春娥,韓海艷，等.十二烷基苯磺酸鈉對雄性小鼠生育力的影響[J].中國衛生檢驗雜志,2012,22(8):1836-1842.

[6]張 穎,任春娥,喬鵬云，等.直鏈烷基苯磺酸鈉對雄性小鼠生精功能亞慢性毒性作用研究[J].生殖醫學雜志,2012,21(5):459-464.

[7]趙文紅,張 鼎,周純先，等.直鏈烷基苯磺酸鈉對黑腹果蠅生殖能力及壽命的影響[J].中南大學學報(醫學版),2011,36(2):154-158.

[8]陳玉明,盧少勇,朱 旭，等.泥鰍在污染物毒性評價中的應用[J].生態毒理學報,2013,8(4):447-455.

[9]胡偉華,何 輝,袁勇超，等.敵百蟲、溴氰菊酯對大鱗副泥鰍仔魚及多刺裸腹溞的急性毒性實驗[J].淡水漁業,2017,47(1):66-70.

[10]戴瑜來,王宇希,潘彬斌，等.幾種常用水產藥物對大鱗副泥鰍苗種的急性毒性試驗[J].淡水漁業,2015,45(4):104-107.

[11]于淑池,夏 秋.LAS與百螺敵對泥鰍的聯合毒性研究[J].安徽農業科學,2008,36(24):10498-10500.

[12]蘇應兵,廖詠玲,楊代勤,等.溫度對泥鰍受精卵孵化和仔魚活力的影響研究[J].安徽農業科學,2011,39(35):21822-21823,21828.

[13]史改花,杜啟艷,張曉亞，等.大鱗副泥鰍性腺發生和分化的組織學研究[J].河南師范大學學報(自然科學版),2008,36(6):163-166.

[14]張學佳,紀 巍,康志軍，等.烷基苯磺酸鈉(LAS)在環境水體中的自然降解[J].黑龍江水專學報,2008,35(2):75-80.

[15]王欽德,楊 堅.食品試驗設計與統計分析 [M].第二版.北京:中國農業大學出版社,2010:126-127.

[16]尹伊偉,張甫英,張甬元.LAS和DEHP對草魚胚胎和魚苗的毒性效應[J].生態科學,1992,(2):115-118.

[17]張博文.三類鈉鹽陰離子表面活性劑對細胞增殖的影響作用研究[D].北京：北京服裝學院,2014.

[18]瞿中和,王喜中,丁明孝.細胞生物學 [M].第四版.北京:高等教育出版社,2011:61.

[19]吳繼法.典型有機污染物脅迫對鱸魚生物標志物系統影響的研究[D].北京：中國科學院研究生院(海洋研究所),2005.

[20]余坦健.苯酚和十二烷基苯磺酸鈉對奧尼羅非魚免疫功能的影響[D].廣東湛江：廣東海洋大學,2006.

[21]彭德姣,唐 慶,胡 南，等.直鏈烷基苯磺酸鈉對鯉魚的慢性毒性損傷的酶學診斷[J].環境科學動態,2004,(2):4-7.

[22]楊 帆,孫翰昌.直鏈十二烷基苯磺酸鈉對中華倒刺鲃SOD和GSH-Px的活性影響[J].淡水漁業,2009,39(5):71-75.

[23]張振生.洗衣粉抑菌作用的初步觀察及應用[J].日用化學工業,1982,(6):23-26.

[24]Tolls J，Lehmann M P，Sijm D T H M.Quantification of in vi-vo biotransformation of the anionic surfactant C-12-2-linear alkyl benzene sulfonate in fathead minnows[J].Environ Toxicol Cem,2000,19(10):2394-2400.

[25]Trivedim S P,Kumar M,Mishra A,et al.Impact of linear alkyl benzene sulphonate(LAS) on phosphatase activity in testis of the teleostean fish,Heteropneustesfossilis(Bloch)[J].J Environ Biol,2001,22(4):263.