發酵乳桿菌PCC及干酪乳桿菌431對免疫低下型小鼠的免疫調節作用研究

陸文偉，陸靜，楊震南，丁歷偉，葉佳蓉，陳衛

（1.江南大學食品學院，江蘇無錫214000；2.杭州味全食品有限公司，杭州310018）

0 引言

益生菌(Probiotics)是一類口服一定量后能夠對宿主健康具有促進作用的活體微生物，又被稱之為微生態制劑或活菌制劑[1]。目前，可作為益生菌的微生物主要包括乳酸菌、乳桿菌、雙歧桿菌、腸球菌、乳球菌、明串珠菌等多個菌屬。益生菌具有多種生物活性，包括防治便秘，調節消化道菌群平衡[2]；促進營養物質的消化吸收[3-4]；刺激機體的免疫系統，促進免疫功能成熟，提高機體的免疫防御機能[5]；預防和輔助治療抗生素引起的腹瀉等[6]。在上述生理活性中，增強宿主免疫防御機能則屬于益生菌在非消化系統中發揮的生理功能。

益生菌可通過局部免疫調節免疫球蛋白IgA、IgG分泌，繼而提高其濃度，調節機體免疫或通過激活宿主巨噬細胞、T細胞、NK細胞、DC細胞等來增強機體的免疫[7]。例如，乳酸菌能夠促進T、B淋巴細胞增殖分化成漿細胞并產生IL-2、IL-10、IgA、IgG；并提高單核巨噬細胞的吞噬活性，誘導活性氧、溶酶體酶等分泌[8-9]。張志焱等報道指出，乳酸菌發酵上清液可促進肉仔雞的免疫器官發育，提高血清中IgG含量[10]。何穎等人研究發現微生態制劑NS復合乳酸菌可提高斷奶仔豬體液血清中IgM、IN F-γ含量，從而增強仔豬體液免疫[11]。李理等人研究發現，小鼠口服乳酸菌后會誘導由塵螨引起的氣道炎癥型小鼠的T細胞釋放IL-10，降低Th1/Th2水平[12]。因此，乳酸菌在增強機體或宿主細胞的免疫能力過程中，菌株可誘導TN F、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10產生，從而到增強免疫的效果[13-15]。

本研究依據環磷酰胺免疫抑制效果建立免疫功能低下小鼠模型，隨后分別口服益生菌株431和PCC 3周。根據試驗小鼠的免疫蛋白指標IgM、IgG和細胞因子IL-6、IL-10、IL-17的變化及益生菌干預后小鼠上呼吸道菌群α、β多樣性，分析益生菌株干預對免疫低下小鼠的免疫調節作用。

1 實驗

1.1 材料與試劑

六周齡BALB/c小鼠40只(合格證號：SCXK（蘇）2017—0007，許可證號：SCYK（蘇）2017—0050)，購買于揚州大學比較醫學中心。Lactobacillus fermentum PCC及Lactobacillus casei431；M RS培養基(青島海博生物技術有限公司)；糞便基因組提取試劑盒(美國MP Biomedicals公司)；本研究所用引物購于生物工程(上海)股份有限公司，其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

GRP-9160型隔水式恒溫培養箱(上海森信實驗儀器有限公司)；RC BIOS 10型冷凍離心機(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；FE-20型pH計(瑞士梅特勒-托利多公司)；MiSeq測序儀(美國Illumina公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌懸液的制備

采用M RS液體培養基，37℃條件下靜止培養L.fermentumPCC及L.casei431，生長至穩定前期時，室溫條件下5 000 r/min離心5 min收集菌體，菌體沉淀用pH 7.4磷酸鹽緩沖液清洗后，制成5×108CFU/mL菌體懸液。

1.3.2 動物分組及處理條件

將BALB/c小鼠隨機平均分為4組：空白組、環磷酰胺對照組、環磷酰胺+PCC組、環磷酰胺+431組，4組小鼠適應性1周后正式試驗。小鼠分組及口服菌株情況如表1所示，且試驗組小鼠灌胃劑量為

1.3.4 16S rRNA擴增分析

采用N anoD rop2000和瓊脂糖凝膠電泳評價宏基因組提取效果，通過引物341F(CCTAYGGGRBGCASCAG)和806R(GGACTACNNGGGTATCTAAT)擴增細菌16S rRNA的V 3-V 4區域。并將PCR純化產物構建M iSeq PE300測序文庫，通過M iSeq測序分析儀獲取序列信息，對序列Q 30/Q 20質控分析，觀察試驗小鼠咽部菌群各分類學水平上的變化。

1.4 生物信息學分析

使用Q IIM E(v1.9.0)分析平臺對質控序列進行物種組成分析，并根據分組信息，進一步分析試驗組小鼠咽部菌群的α、β多樣性。

1.5 數據統計分析

實驗中不同組之間的差異顯著性通過GraphPad Prism 5.0軟件進行單因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)判斷(Tukey’s檢驗)，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

5×108CFU/mL。

1.3.3 免疫指標的測定

采用ELISA法測定試驗小鼠外周血清中細胞因子及免疫球蛋白。

表1 小鼠分組情況

2.1 菌株PCC及431調節免疫低下型小鼠細胞因子水平

2.1.1 菌株PCC及431對促炎癥因子的調節作用

益生菌攝入后會對宿主機體免疫細胞產生的一系列細胞因子產生免疫調節作用，主要是通過影響宿主效應細胞所產生的細胞因子來發揮其免疫調節作用的[15-16]。促炎癥因子IL-6可誘導活化B淋巴細胞合成免疫球蛋白，增加免疫細胞IgA、IgG、IgM的分泌，亦可誘導T細胞的活化、增殖和分裂[17-19]。如圖所示，環磷酰胺導致的免疫低下使得小鼠血清中IL-6、IL-17、TNF-α、IL-1β濃度均降低。其中，環磷酰胺組的IL-6含量由113.1±8.78 pg/mL下降至100.4±7.42 pg/mL；TNF-α的濃度則由518.8±27.05 pg/mL下降至468.2±36.58 pg/mL；同時，IL-1β的含量也由113.6±8.95 pg/mL下降至112.8±8.76 pg/mL。如圖2-A所示，較空白組而言，模型組IL-6的濃度降低(IL-6的濃度由113.1±8.78 pg/mL降低至100.4±7.42 pg/mL)；而干預組與模型組相比較，PCC組IL-6則由113.2±7.67 pg/mL恢復至空白組水平且具有顯著性差異(P＜0.01)。IL-17是Th17細胞分泌的一種促炎癥性細胞因子，在自身免疫性疾病中，均異常表達。IL-17可誘導炎癥因子以及趨化因子的表達，聚集較多的免疫細胞至炎癥部位加劇機體的炎癥反應。圖1-B所示，PCC菌組的IL-17含量可由67.8±4.87 pg/mL恢復至79.9±5.95 pg/mL，且調節作用顯著(P＜0.01)。綜合圖1-C和1-D分析可知TN F-α表達水平在模型組與益生菌干預組間均無顯著性差異。

2.1.2 菌株PCC及431對抑炎癥性細胞因子的調節作用

圖1 小鼠血清促炎癥因子的濃度散點分布圖

TGF-β生物學功能主要在炎癥、組織修復和胚胎發育等方面。文獻調研發現TGF-β對細胞的生長分化和免疫功能均具有重要的調節作用[20]。而對于益生菌干預免疫低下型小鼠TGF-β的分泌表達尚不清晰，因此本研究探討免疫低下小鼠TGF-β表達水平及與其它細胞因子水平的關聯性。如圖2-A所示，益生菌干預組與模型組相比較而言，TGF-β表達可恢復至空白組水平，其中PCC菌組含量可由181.5±15.16 pg/mL提高至216.5±15.63 pg/mL，431菌組則提高至 196.2±14.44 pg/m l，且PCC菌干預效果更顯著，由此可知，益生菌干預可促進抑炎癥因子的分泌，具有調節作用。

圖2 小鼠血清抑炎癥因子的濃度散點分布圖

IL-10是公認的炎癥與免疫抑制因子。IL-10抑制單核巨噬細胞釋放炎癥介質，抑制LPS和IFN-γ導致的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8分泌。圖2-B所示結果表明，PCC菌、431菌組的IL-10的表達水平與模型組相比較，PCC菌組的IL-10濃度由570.8±44.34 pg/mL提高至646.9±48.63 pg/mL，431菌組則提高至670.6±48.95 pg/mL，且益生菌干預組組間差異顯著。同時，結合D圖所示可知，IFN-γ的分泌表達水平在干預組間無差異性，可能是IL-10的分泌表達抑制小鼠單核巨噬細胞所釋放的炎癥介質，抑制IFN-γ的分泌表達。研究中PCC菌干預后，IL-2的表達水平呈現下調趨勢，而431菌組較模型組分析可發現，呈現上調趨勢，趨勢同于空白組。

2.2 菌株PCC及431對小鼠免疫球蛋白的調節作用

免疫球蛋白是一類在外界或自身抗原物質刺激下，宿主機體所產生的分布于宿主機體外周血、組織等具有相近構造和抗體活性的物質[23-24]。IgG是血清主要的抗體成分，約占血清Ig的75%。IgG在結合補體、增強免疫細胞吞噬病原微生物和中和細菌毒素的能力方面，具有重要作用[24]。

圖3 小鼠血清中免疫球蛋白的濃度散點圖

由圖3所示的IgM和IgG濃度變化可知，PCC菌和431菌對IgM的分泌均具有促進效果。PCC菌組小鼠血清中的IgM含量由51.2±3.86 pg/mL提高至60.8±3.86 pg/mL，433菌組IgM含量提高到55.9±2.80 pg/m l，且干預組組間差異顯著(P＜0.01)。試驗小鼠體液中的免疫因子IgG的在兩株益生菌株干預后，呈現出不同的現象。其中，PCC組的IgG濃度由296.6±32.42 pg/mL提高至360.7±19.63 pg/mL（P＜0.01），而431組濃度變化較模型組分析，差異不顯著。IgG、IgM的合成、分泌以及IgG、IgM介導的免疫應答依賴于其它細胞輔助，主要是黏膜相關的淋巴組織的T細胞和其分泌的細胞因子。因此，益生菌干預時，小鼠血液中IgG、IgM的分泌水平與其它細胞因子間具有關聯性。

2.3 菌株PCC及431調節免疫低下小鼠上呼吸道菌群

2.3.1 免疫低下小鼠咽部菌群α多樣性

α多樣性可反映測定樣本內微生物群落豐度及多樣性，依據其菌群計算指標的不同反映其物種組成上的多樣性及豐富度。因此，本研究中采用Illumina MiSeq PE300測序儀分析益生菌干預免疫低下型小鼠其咽部菌群的變化情況。如圖4所示，豐度指數Cha01數值增大，則物種總數增多；且Simpson指數值隨測序深度增大，趨于平緩，說明本研究中測序數據合理。根據goods_coverage指數可反映出小鼠咽部微生物種屬多樣性在序列數達到20 000條時，其多樣性數據變化不大；基于PD—whole tree指數可反映出小鼠的咽部菌群的多樣性較高。

圖4 小鼠咽部菌群α多樣性各項指數

2.3.2 免疫低下小鼠咽部菌群屬水平上的變化

基于不同分類地位核心菌群相對含量的分析，使用Green genes數據庫對OTU代表性序列進行同源性比對分析，將所有序列依次鑒定至屬水平[25]。基于屬水平菌群的比較分析可知，試驗組小鼠呼吸道菌群在其屬分類水平上的呈現出不同變化，其中免疫低下小鼠咽部優勢菌群相對含量提高(A圖)。如B圖所示，相對豐度較高的菌屬為Allobaculum、Akkermansia、雙歧桿菌屬、乳桿菌屬等。其中，凝結桿菌屬的相對豐度變化在環磷酰胺組(42.79%)、PCC組(46.32%)顯著高于空白組，差異性顯著（P＜0.05）；Allobaculum屬在環磷酰胺組及干預組均顯著高于空白組；Akkermansia、雙歧桿菌屬、乳桿菌屬所呈現出的變化是431菌組高于其它組。

2.3.3 免疫低下小鼠上呼吸道菌群β-多樣性

基于上述試驗組免疫小鼠屬分類水平初步可知，益生菌干預免疫低下小鼠的咽部微生物群落結構不同。為進一步分析益生菌干預免疫低下型小鼠其咽部微生物群落結構上的差別，依據測定樣品的OTU信息構建非加權Unifrac距離矩陣，基于這一矩陣進行主坐 標 分析(Principal Co-ordinates Analysis，PCoA)[26]。如圖6所示，主坐標1及主坐標2其解釋總變量的12.46%和4.34%，且基于OTU水平上，試驗組小鼠間的微生物群落呈現出不同分布，小鼠個體間差異較大，且不同組別間具有差異，相同組別間聚類。其中，口服PCC菌的小鼠較其它三個試驗組而言，區分度顯著；環磷酰胺對照組小鼠較空白組間而言，距離較遠，模型組小鼠咽部微生物菌群與正常組具有差異性；同時口服431菌組中部分小鼠菌群多樣性與空白組相近，由此可知免疫低下小鼠口服益生菌株可調節其咽部的菌群變化。

圖5 試驗組小鼠咽部菌群在屬水平上分布

圖6 小鼠咽部菌群PCoA分析圖

3 結論

益生菌株刺激機體的免疫系統，促進免疫細胞的成熟，提高機體的免疫防御機能。因此，外源性的攝入益生菌株對免疫抑制型宿主呈現出不同程度的調節效果[27]。本研究選用的益生菌株L.fermentumPCC及L.casei431對免疫低下型小鼠血清中部分促炎癥性及抑炎癥性細胞因子的分泌和免疫蛋白表達具有調節作用。同時，益生菌株干預后，小鼠咽部微生物群的多樣性趨勢同于空白組。上述分析結果表明，Lactobacillus.PCC及L.casei431對免疫低下小鼠具有免疫調節作用，能夠調節因免疫低下造成的菌群變化。因此，益生菌株PCC和431可作為潛在的免疫調節型菌株。

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