不明原因復發性流產的免疫治療策略

吳培莉 薛 晴 綜述 楊慧霞 審校

北京大學第一醫院(100034)

復發性流產(RSA)導致原因很多，包括染色體異常、感染、內分泌因素、子宮解剖結構異常、抗磷脂抗體綜合征和其他自身免疫性疾病等[1]。但是，仍有約50%的RSA患者病因不明，稱為不明原因的復發性流產(URSA)[2]，可能的原因是母體免疫耐受失衡[3]。免疫細胞失衡誘發的母體免疫不耐受與URSA的發生密切相關，其中兩個最重要的平衡體系(Th1/Th2平衡和Th17/Treg平衡)是生理妊娠所必須的[4-5]。Th1和Th2細胞是具有不同細胞因子特征的T淋巴細胞亞群。Th17細胞是CD4+陽性且能夠分泌IL-17的T淋巴細胞，其分泌的IL-17是一種能夠誘導多種炎性因子表達的促炎因子。調節性T細胞能夠分泌IL-10和TGF-β，抑制Th1和Th17介導的炎癥反應。在正常妊娠的母胎界面，是以Th2和Treg細胞為主導的，但是在URSA患者的外周血和蛻膜組織中Th1/Th2及Th17/Treg比值往往升高。Th1/Th2和Th17/Treg的比例失衡是URSA免疫異常的重要因素[6-7]。本文就能夠改善URSA免疫失衡的治療策略相關研究進行綜述。

1 子宮內膜干細胞樣細胞治療

子宮內膜干細胞樣細胞包括間充質干細胞(MSCs)和上皮祖細胞，對月經脫落后子宮內膜的循環再生至關重要。MSCs是成纖維細胞樣祖細胞的異質群體，其特征在于其自我更新和分化成各種細胞類型的能力。子宮內膜MSCs的減少不僅限制子宮內膜再生的內在能力，而且也影響子宮內膜蛻膜化，從而導致妊娠失敗[8]。一項前瞻性非對照I期臨床試驗，納入的26例復發性宮腔粘連致不孕的患者，在行粘連分解手術后，子宮腔接受1×107臍帶來源的間充質干細胞移植，3個月后患者宮內粘連評分明顯降低，30個月后隨訪發現其中10人成功妊娠[9]。MSCs的多功能性使其成為近幾年被發現和研究的對象。

RSA患者的母胎界面存在Th1/Th2細胞因子的不平衡，而MSCs具有有效免疫調節功能，可調節Th1型細胞因子應答以促進Th2型優勢的形成[10-11]。動物實驗發現，具有流產傾向的小鼠在種植窗期通過腹腔注射接受同種小鼠脂肪來源的MSCs后，其胚胎吸收和流產率降低，同時，MSCs治療能夠明顯抑制對抗父源抗原的脾臟細胞的增殖[12]。此外，研究結果表明，MSCs治療增加了母鼠蛻膜和胎盤中Th2型因子IL-4，IL-6，IL-10和GM-CSF的分泌，同時降低了Th1型因子IL-12，IL-2和IFN-γ的表達，提示Th1/Th2平衡的改善是MSCs的治療機制之一[12]。也有研究表明，骨髓來源的MSCs通過尾靜脈注射給具有流產傾向的小鼠模型也得到相似結果[13-14]。但是目前尚缺乏臨床證據。

2 免疫細胞或免疫球蛋白輸注治療

在母胎界面，絨毛滋養層細胞表面缺乏經典的主要組織相容性復合體(MHC)I類分子(除HLA-C外)和MHC II類分子，具有較弱的抗原特性。但妊娠期間這些細胞仍具有誘導母體免疫激活和產生抗父親HLA抗體的能力，從而破壞免疫耐受。因此，妊娠期間，多種免疫細胞會被募集到母胎界面以確保和促進妊娠過程。蛻膜是母體免疫系統對胎兒抗原產生耐受性的重要場所，然而在URSA患者的蛻膜中免疫細胞的比例及功能均呈現不同程度異常[15]。

2.1 自然殺傷細胞(NK)輸注

在早孕期母胎界面的母體蛻膜中，>70%的白細胞是NK細胞，胎盤形成后，NK細胞的數量驟減。NK細胞表面的特異性受體可以與蛻膜間質細胞及滋養層細胞表面的配體相互作用，介導NK細胞在早孕期母胎界面的獨特功能，包括促進蛻膜螺旋動脈重塑，蛻膜化，滋養層細胞的侵襲和免疫平衡[16]。其中CD49a+Eomes+NK細胞占總NK細胞>80%，能夠分泌多種促進胚胎發育生長的生長促因子。研究表明，復發性流產患者的蛻膜組織中，CD49a+Eomes+NK細胞所占比例顯著下降，且生長因子的表達與正常對照組相比明顯下降，這可能與復發性流產的發生密切相關[17]。動物實驗發現，將體外誘導的子宮樣CD49a+Eomes+NK細胞經尾靜脈注射到孕鼠體內，細胞經檢測能夠到達孕鼠的母胎界面，并且能夠釋放胎兒生長所需的足夠的生長促因子。因此該研究提示CD49a+Eomes+NK細胞的輸注有望通過增加母胎界面生長促因子的水平來改善不良妊娠結局[17]。

2.2 樹突狀細胞(DC)輸注

DC屬于抗原提呈細胞，能夠識別和處理捕獲的抗原并將其呈遞給T細胞從而激活T細胞啟動適應性免疫反應。除了啟動初級免疫應答外，DC還參與免疫耐受的誘導[18]。妊娠后蛻膜DCs會分化成占大部分的DC-SIGN+iDC和少量的CD83+mDC，提示蛻膜化與DC-SIGN+iDC的增加和CD83+mDC的減少相關。研究表明DC-SIGN+iDC細胞可在妊娠期間誘導Treg細胞的生成，促進子宮內膜蛻膜化、血管生成，募集NK細胞等，參與母體對胎兒抗原的免疫耐受[19-20]。既往研究也發現，URSA患者母胎界面的蛻膜中DC-SIGN+iDC較正常對照組明顯下降[21]。將發揮免疫耐受作用的DC用于復發性流產的免疫治療值得期待。已有動物實驗表明，具有流產傾向的孕鼠在接受骨髓來源的DC靜脈注射后，孕鼠的流產率(2/48，4.2%)顯著低于對照組(11/42，26.2%)[22]。

2.3 調節性T細胞(Treg)輸注

妊娠期間母胎界面胎兒抗原的存在能夠誘導Treg細胞從外周血到母體脫膜，介導免疫抑制作用。Treg細胞表面表達或分泌的一系列分子可通過不同的機制直接促成其抑制功能。有研究表明，與正常對照組相比，RSA患者蛻膜中的Treg細胞不僅數量減少，而且免疫抑制效力也減弱(IL-10和TGFβ的分泌減少)[15]。有動物實驗證實，CBA/J小鼠(n=10)在與BALB/c交配之前通過尾靜脈輸注同種屬來源的由妊娠誘導形成的CD4+CD25+Treg細胞，可增加孕鼠母胎界面IL-10和TGFβ的表達，顯著降低由外源性rIL-17誘發的孕鼠流產率(12/96，12.5% vs 28/101，27.7%)[23]。

但是，目前關于輸注以上3種免疫細胞對于流產的治療可能性僅局限在動物實驗水平，尚缺乏臨床數據的支持，但為未來臨床URSA的治療提供了更多可能性。

2.4 淋巴細胞治療

封閉抗體是妊娠女性血清中含有的針對胚胎人類白細胞抗原Ⅱ和滋養細胞交叉抗原產生的IgG抗體，通過與滋養細胞結合或與母體淋巴細胞表面抗原結合，防止胚胎父系抗原被母體免疫系統識別觸發的免疫攻擊。對封閉抗體缺乏的RSA患者，采用配偶淋巴細胞免疫治療(ALIT)后，大多數患者的封閉抗體會轉陽。有研究指出ALIT治療可調節外周免疫耐受異常，使機體在生理條件下對父系抗原產生耐受，其可能機制是通過提高CD4+、CD8+、CD3+、CD25+Treg細胞水平，促使Th1型細胞向Th2型轉化，降低促炎因子IL-2、TNFα和IFNγ水平等[24]。

既往關于ALIT的臨床治療效果存在較大爭議。20世紀末，ALIT提高URSA患者活產率的治療效果被初步認識，但隨后也有研究對ALIT的治療效果提出異議。例如，一項對照試驗的結果顯示，與安慰劑相比，ALIT治療組的活產率(31/86，36%)與對照組(41/85，48%)比較無統計學差異[25]。2011年由英國皇家婦產科醫師學會頒布的復發性流產診治指南也不推薦進行封閉抗體檢查和ALIT治療[26]。近幾年已經鮮有關于RSA患者接受ALIT治療的臨床研究。但也有文獻報道，ALIT的治療效果與RSA患者接受其治療的次數和注射方式不同有關，患者封閉抗體轉陽率與接受ALIT治療次數呈正相關。此外，在注射次數相同的情況下，皮內注射組封閉抗體轉陽率高于皮下注射，且皮內注射誘導產生Treg細胞、糾正Th1/Th2平衡所需的時間更短[27]。所以，ALIT治療效果的爭議性可能與淋巴細胞的應用方法不同有關，需要針對淋巴細胞不同應用方法的更大樣本量的臨床研究來明確ALIT的治療效果。

2.5 靜注免疫球蛋白

靜注免疫球蛋白(IVIG)是一種被動免疫方法，有研究提示IVIG可以中和循環系統中的自身抗體，增強Treg細胞介導的免疫耐受功能，并減弱Th17細胞依賴性免疫應答，促進Th1向Th2型細胞轉化，抑制NK細胞毒性，減弱補體介導的細胞毒性免疫調控作用[28]。

有研究表明，URSA患者妊娠后靜脈應用IVIG(400mg/kg),每4周1次直到妊娠32周結束，發現外周血中Th17細胞及炎性因子IL-17降低，Treg細胞及抗炎因子TGF-β和IL-10 升高，而且活產率(86.3%，38/44)較對照組(42%，21/50)高[29]。但IVIG是否對治療URSA有效仍存在爭議。Egerup[30]的一項meta分析指出，與安慰劑相比，IVIG治療未能提高URSA患者的活產率，但是亞組分析發現IVIG可能會使繼發性URSA患者受益。近期一項納入1994年-2015年11項RCT研究的meta進行亞組分析發現，IVIG對原發性和繼發性URSA患者的治療均無明顯效果，但妊娠前使用IVIG較安慰劑組會提高活產率(RR 1.67,95%CI 1.30～2.14,P<0.0001)[31]。因此，目前IVIG應用的指征和治療方案尚不明確，其療效及安全性也尚不統一，IVIG 是否應用于URSA仍存爭議。

3 粒細胞集落刺激因子

粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的主要作用是促進嗜中性粒細胞增殖及其在骨髓中的分化，控制嗜中性粒細胞在血液中的釋放。近些年，研究表明胎兒絨毛和母體蛻膜組織均能釋放G-CSF，在妊娠女性血清中維持在高水平，不僅影響胚胎植入和卵巢功能，而且還促進子宮內膜修復，利于成功妊娠[32]。體外實驗發現G-CSF可以抑制T細胞的異種反應性，使T細胞處于免疫低反應狀態[33]。體內實驗表明G-CSF可以誘導Th1向Th2細胞轉化，降低Th17細胞水平，增加Treg細胞水平[34]。

Santjohanser等[35]進行了一項回顧性隊列研究，將選擇ART的127例URSA患者分為G-CSF治療組(49例，72個周期)，以及未接受藥物治療和接受可的松或靜脈注射免疫球蛋白或低分子量肝素治療組(78例，127個周期)。G-CSF治療組中11例患者接受1×34Mill單位/周的G-CSF，另38名接受2×13Mill單位/周的G-CSF，直至妊娠第12周，G-CSF組臨床妊娠率和活產率均顯著高于對照組；亞組接受1×34Mill單位/周G-CSF治療的患者成功分娩率(72%)高于2×13Mill單位/周(21%)。所以，對于URSA患者，G-CSF似乎是一種安全且有前景的免疫治療選擇，但仍需更多的研究來優化治療方案和評估藥物安全性。

4 其他常見治療藥物

4.1 環孢素

環孢素A(CsA)是一種免疫抑制劑，廣泛用于器官移植和自身免疫性疾病的治療。C-X-C趨化因子受體4(CXCR4)和C-X-C趨化因子配體12(CXCL12)對于胚胎滋養層細胞和母體蛻膜細胞建立聯系至關重要，參與母胎界面NK細胞的募集和胎盤植入等過程[36]。基礎研究表明，CsA可以上調絨毛滋養細胞CXCL12/CXCR4的表達[37]。正常妊娠時，母胎界面Th1/Th2向以Th2型細胞為主的模式轉化。研究表明CsA可增加滋養層細胞中Th2型細胞因子IL-4和IL-10的產生，同時抑制Th1型細胞因子IFN-γ產生，從而促進母胎界面Th2優勢，介導免疫耐受[38]。動物研究也表明，低劑量CsA(1.0 mg/kg)可促進鼠母胎界面Th2型優勢，促進絨毛細胞的增殖和侵襲，使具有流產傾向孕鼠的胚胎吸收率顯著降低(9/86，10.47%比25/88，28%)，提示CsA的應用有助于胎兒免受母體的免疫攻擊，維持正常妊娠[39-40]。一項前瞻性非隨機對照試驗，將納入的URSA患者分為CsA治療組(66例)和對照組(20例)，治療組患者從被確認妊娠后開始口服CsA(100mg/d)共30d，對照組為黃體酮每天20mg直到妊娠12周。結果表明CsA治療組的活產率(41/66，62.1%)顯著高于對照組(6/20,30%)，而且妊娠女性沒有出現明顯副作用，未觀察到胎兒宮內發育遲緩或出生缺陷[41]。研究提示低劑量CsA治療可提高URSA患者的活產率，但目前CsA治療URSA的臨床研究尚少，其治療效果以及安全性評估仍待大樣本臨床研究驗證。

4.2 TNF-α抑制劑

TNF-α是Th1細胞分泌的炎性因子，在URSA患者的血液和蛻膜中的表達較正常女性明顯升高[42]。高表達的TNF-α可以抑制滋養細胞的侵襲和增殖，促進滋養細胞和蛻膜螺旋動脈周圍血管平滑肌細胞的凋亡[43]。

有研究表明，接受TNF-α抑制劑-依那西普治療的URSA患者外周血中，具有毒性作用的NK細胞活性明顯降低，尤其是在成功妊娠的URSA患者中。但是，依那西普治療前后外周血中Treg細胞的活性未見明顯變化，提示依那西普可能對有高NK細胞活性的流產患者是有效的治療方法[44]。此外，一項回顧性研究表明，給予URSA患者聯合應用抗凝劑、免疫球蛋白和TNF-α抑制劑組(17例)與僅聯合應用抗凝劑和免疫球蛋白組(37例)相比，兩組的活產率無明顯差異，但可能是兩組納入人群數量小不足以產生有統計學意義的組間差異[45]。所以，更多的臨床大樣本前瞻性研究對于準確評估TNF-α抑制劑的治療效果及安全性是必需的。

4.3 維生素D

維生素D除了參與骨代謝和礦物質平衡，還可以調控免疫系統，例如能夠促進Th1向Th2型細胞的轉化，促進Th17向Treg型細胞的轉換，抑制T細胞的增殖等[46]。有研究發現，URSA患者蛻膜中維生素D 的表達較正常對照組降低，且維生素D的表達與母胎界面促炎因子IL-17和IL-23的表達呈負相關，與抗炎因子TGF-β的表達呈正相關[47]。研究也發現，URSA患者補充維生素D(0.5μg/d)2個月后，外周血IFN-γ+Th和TNF-α+Th細胞的比例會降低，NK細胞的毒性也會明顯下降[48]。

一項雙盲的臨床藥物研究，將納入的伴有維生素D缺乏且近3個月未補充維生素D治療的URSA患者分為藥物治療組(22例)和對照組(22例)，所有患者每隔4周接受3個療程的淋巴細胞免疫治療，同時治療組接受1次300 000U維生素D的肌內注射，3個月后收集兩組患者的血標本進行檢測。結果顯示兩組Th17細胞的比例較治療前均下降，但維生素D治療組Th17細胞下降趨勢更明顯；Treg細胞的比例較治療前均上升。治療10個月后隨訪發現，對照組8例(8/22，36.4%)妊娠,其中6例在妊娠6～12周時發生流產，而維生素D治療組10例(10/22，45.5%)妊娠，其中有5例已成功分娩，另5例持續妊娠中[49]。研究結果提示維生素D的應用對于改善URSA的妊娠結局有一定效果，但仍需大樣本的RCT研究來明確能夠使URSA患者獲得最佳治療效果的維生素D的最佳注射劑量和時間。

4.4 糖皮質激素

糖皮質激素具有顯著的抗炎作用,能夠抑制子宮內膜NK細胞的數量和活性，抑制樹突狀細胞對T細胞免疫的激活作用，抑制Th1型免疫，促進Th2型免疫，并能增加Treg細胞的生成促進免疫耐受[49]。但糖皮質激素能否改善URSA的妊娠結局仍存在爭議。一項meta分析表明，與安慰劑組相比，潑尼松龍的治療能夠顯著提高URSA患者的活產率(納入2項RCT研究，RR 1.58,95%CI 1.23～2.02),降低流產率(納入3項RCT研究，RR 0.42，95%CI 0.28～0.61)[51]。但是，有研究指出，妊娠期間應用大劑量潑尼松龍(40～50 mg/d)并沒有提高RSA患者的活產率,反而會誘發早產、糖尿病、高血壓等不良反應[52]；另一項研究發現，低劑量潑尼松龍治療(20mg/d持續6周+10mg/d持續1周+5mg/d持續1周共計7周)使URSA患者的活產率比安慰劑組高出20%，但是由于樣本量小，兩組之間并無統計學差異[53]。研究結果提示加強低劑量潑尼松龍對URSA的治療效果的探索是必要的。

綜上所述，目前URSA的免疫治療選擇較多，但療效仍存在爭議，所以，大樣本、多中心、前瞻性隨機對照試驗對于探索和制定合理有效的治療方案尤為必要。此外，新的免疫治療方向也仍在積極探索之中，期待盡快向臨床應用轉化。