轉化生長因子-β1對慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉上皮緊密連接屏障功能的影響

矯 健 張 羅，2*

(1. 首都醫科大學附屬北京同仁醫院耳鼻咽喉頭頸外科 北京市耳鼻咽喉科研究所 教育部耳鼻咽喉頭頸科學重點實驗室 鼻病研究北京市重點實驗室,北京 100730；2. 首都醫科大學附屬北京同仁醫院鼻過敏科，北京 100730)

慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps， CRSwNP)是以鼻竇鼻腔黏膜的慢性炎性反應及息肉形成為主要特征的上呼吸道常見疾病，在全球人口中發病率為0.5%～4%，主要癥狀為鼻塞、黏性或黏膿性鼻涕、頭面部脹痛、嗅覺減退或喪失等，嚴重影響患者的生活質量[1]。鼻息肉發病與多種因素有關，如遺傳因素、免疫缺陷、纖毛功能障礙、阿司匹林耐受不良等，但發病機制至今尚不明確。

鼻黏膜上皮細胞間緊密連接(tight junction， TJ)屏障是呼吸道屏障功能的重要組成成分，主要由多種跨膜蛋白如claudin家族、occludin、tricellulin和骨架蛋白如zonula occludens(ZO)-1、ZO-2、ZO-3、cingulin組成[2-3]。其主要功能為：調控上皮細胞間的密閉性和通透性，阻止外界致病原如細菌、病毒和過敏原等進入機體；調節細胞的增生和分化；參與機體信號轉導和固有免疫等[4-5]。

鼻黏膜上皮屏障功能破壞與鼻息肉發病密切相關，Soyka等[6]在西方鼻息肉患者人群中研究發現，鼻上皮屏障功能受炎性因子γ干擾素(interferon-γ, IFN-γ)和白細胞介素-4(interleukin-4，IL-4)調控。本實驗室前期研究[7]也提示，在中國鼻息肉患者中，鼻黏膜中緊密連接蛋白ZO-1和claudin-1表達量降低，但是關于中國鼻息肉患者鼻上皮緊密連接功能的調控機制尚不清楚。

轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1， TGF-β1)是一種具有顯著免疫調節和致纖維化功能的多效性細胞因子，在免疫抑制和組織重塑中發揮重要作用。此外，TGF-β1還可在多種細胞類型中調控上皮緊密連接屏障功能如人肺上皮細胞、人支氣管上皮細胞、人腸上皮細胞等[8-10]。盡管已知TGF-β1在鼻黏膜炎性反應的組織重塑中發揮重要作用，但是關于其對鼻黏膜上皮屏障功能的調控作用目前尚未有報道，本研究旨在體外培養的鼻黏膜上皮細胞(健康對照及鼻息肉來源的鼻上皮細胞)中探討TGF-β1對上皮緊密連接屏障功能的調控作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究獲首都醫科大學附屬北京同仁醫院倫理委員會批準(批準文號：TRECK 2014-12)，所有受試者均已簽署知情同意書。總計有10例健康對照(6例男性，4例女性，年齡20～60歲)和12例鼻息肉患者(7例男性，5例女性，年齡25～59歲)入組研究。鼻息肉組診斷符合歐洲鼻竇炎及鼻息肉診療指南2012年版(European Position Paper on Rhinosinusitis and Nasal Polyps， EPOS)及中國慢性鼻-鼻竇炎診斷和治療指南(2012年，昆明)[1]，鼻內鏡手術中留取患者鼻息肉組織。健康對照組來自接受鼻中隔校正術的單純鼻中隔偏曲患者，不伴有其他鼻部炎性反應，手術中留取患者的中鼻甲黏膜。術前4周內局部或全身應用糖皮質激素患者除外，真菌性鼻竇炎、后鼻孔息肉、傳染性疾病以及腫瘤患者除外。

引物序列為：EF1α正向引物5′-CTGAACCATCCAGGCCAAAT-3′, 反向引物 5′-GCCGTGTGGCAATCCAAT-3′; claudin-1正向引物 5′-CAGTCAATGCCAGGTACGAATTT-3′, 反向引物 5′-AAGTAGGGCACCTCCCAGAAG-3′; claudin-4正向引物 5′-TGTACCAACTGCCTGGAGGAT-3′, 反向引物 5′-GACACCGGCACTATCACCATAA-3′; occludin正向引物5′-GATGAGCAGCCCCCCAAT-3′, 反向引物 5′-GGTGAAGGCACGTCCTGTGT-3′; ZO-1正向引物 5′-ACAGTGCCTAAAGCTATTCCTGTGA-3′, 反向引物 5′-TCGGGAATGGCTCCTTGAG-3′; ZO-2正向引物5′-CGGTTAAATACCGTGAGGCAAA-3′, 反向引物 5′-GGGAACCACTGGGTGTAATTCA-3′。

1.2 細胞培養、刺激與跨膜阻力(transepithelial resistance， TER)檢測

TGF-β1刺激上皮細胞72 h后，甲醇-丙酮(50∶50)混合液固定上皮細胞，0.3%(體積分數) triton X-100 通透，5%(質量分數)脫脂奶粉封閉。部分細胞用Alexa488標記anti-occludin 抗體 (1∶100， 美國Invitrogen公司)直接染色，部分細胞用anti-ZO-1抗體(1∶200， 美國Invitrogen公司)孵育過夜后，加入Alexa488標記的二抗。DAPI復染后封片，激光共聚焦顯微鏡(奧林巴斯IX 81顯微鏡，日本)下觀察。

1.3 細胞間熒光素通透性檢測

1.4 免疫熒光染色

健康對照鼻黏膜及鼻息肉黏膜組織經蛋白酶消化過夜后，接種于細胞培養皿中，于人支氣管上皮培養基(bronchial epithelial growth medium， BEGM)(美國Lonza公司)中常規培養，待上皮細胞擴增至80%～90%時行胰蛋白酶消化，按照1.5×105細胞/孔密度接種于人胎盤膠原預鋪板的transwell雙層培養皿(美國Corning公司)中開始氣液界面(air-liquid interface， ALI)培養，待上層膜中細胞生長融合后，去除上層培養液，僅從基底側給予DMEM∶BEGM(1∶1)培養基，同時培養基中添加5×10-8mol/L視黃酸，繼續培養至細胞分化完全、TER達到平臺期后(氣液培養21 d左右)開始加藥刺激。TGF-β1(1 ng/mL、10 ng/mL)(美國R & D公司)分別從基底側給予細胞，對照組不作處理，在刺激前(0 h)、刺激后24、48、72 h分別應用TER檢測儀(Millicell-ERS， 美國Millipore公司)測量上皮細胞跨膜阻力。

1.5 mRNA提取與實時熒光定量PCR檢測

TGF-β1刺激上皮細胞72 h后，直接用RLT緩沖液裂解細胞，用RNeasy mini試劑盒(英國Qiagen公司)提取總RNA，提取步驟參照說明書進行。紫外分光光度計檢測RNA濃度(A260/A280在1.8～2.0之間)，1%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。應用QuantScript反轉錄試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)將1 μg RNA反轉錄為cDNA，-20 ℃保存。

根據UltraSYBR Mixture(With ROX)試劑盒說明，檢測各基因mRNA表達情況。擴增程序：95 ℃ 10min，(95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s)×45個循環。以延長因子(elongation factor 1α，EF1α)為內參對照，以熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數(Cycle threshold, Ct)計算相對表達量：相對表達量=2-△Ct，每例樣品重復3次，取平均值。

健康對照來源的鼻上皮細胞間緊密連接蛋白occludin和ZO-1表達呈現連續的線性結構，而鼻息肉來源的上皮細胞間兩種緊密連接蛋白表達模式受到明顯破壞，緊密連接線性結構呈現分離、斷裂等，而經10 ng/mL TGF-β1刺激后，無論是健康對照還是鼻息肉來源的上皮細胞間緊密連接蛋白表達模式均較加藥前有明顯破壞(圖2A、B)。

重慶市婚管中心于2016年9月28日正式啟動重慶市婚姻家庭社會工作“家和計劃”特色服務項目。該項目形成了以重慶市民政局為領導，以重慶市婚姻收養登記管理中心為統籌，以重慶市質量和標準化研究院為標準導向，以各區縣婚姻登記處為依托，以“社區+社工”為載體的服務團隊。

1.6 統計學方法

TGF-β1刺激上皮細胞72 h后，加入熒光素FITC-葡聚糖(FITC-Dextran) (2 mg/mL)于transwell培養皿上層內，37℃培養箱孵育24 h，取下層培養液，酶標儀(ELISA reader Mithras LB940; Berthold Technologies；德國)檢測FITC-Dextran的熒光強度(480 nm)。

2 結果

2.1 TGF-β1刺激對鼻上皮細胞TER和細胞間熒光素通透性的影響

在氣液界面培養21d，鼻息肉來源的上皮細胞TER明顯低于健康對照上皮細胞，而細胞間熒光素FITC-Dextran的通透性則明顯高于對照組上皮細胞(圖 1A)。10 ng/mL TGF-β1刺激上皮細胞72 h，無論是在健康對照還是鼻息肉來源的上皮細胞中，均可明顯降低上皮細胞TER，同時增加細胞間FITC-Dextran通透性，而1 ng/mL TGF-β1刺激72 h，對兩種來源的鼻上皮細胞TER和細胞間FITC-Dextran通透性均無明顯影響(圖1B、C)。

2.2 TGF-β1刺激對鼻上皮細胞緊密連接蛋白表達的影響

“念到您現在所肩的責任的重大，我便連孺慕之思都不敢道及，希望您能原諒我，只要您知道我是真心敬慕您，我便夠快活的了。”

“小劉和報社簽訂有勞動合同，她在所供職報社報紙上發的稿件，取得的收入，與其他收入一起，合并為工資薪金所得，并非新個稅法中所稱的稿酬所得。她投稿給其他媒體、電臺的時評收入，屬于稿酬所得?！睗鲜卸悇站謧€人所得稅處負責人答復，修改后的新個稅法允許勞務報酬、稿酬、特許權使用費等三類收入在扣除20%的費用后計算納稅。也就是說，按原收入額打八折計算納稅。

在靜息未刺激狀態下，鼻息肉來源的上皮細胞中claudin-1 mRNA表達較健康對照上皮細胞有增加趨勢(圖 3A)，而10 ng/mL TGF-β1刺激后，無論是健康對照還是鼻息肉來源的上皮細胞中，TJ mRNA表達水平較未刺激狀態下有增高趨勢，但差異無統計學意義(圖 3B、C)。

在公共英語課教師潛移默化地讓學生接觸專業英語的同時，學?？梢栽诘湍昙夐_設專業英語方面的選修課，讓學生盡早接觸專業英語，待開設專業英語課時，學生對此已不陌生，也不會將課程視為負擔，從而消除畏難情緒，降低教學難度。在教學形式上，教師應考慮到課程既要教授專業英語知識，又要重視英語知識的專業性，要讓學生在專業英語課上也能鞏固平時所學專業知識，使專業課成績不好的學生也能在課上獲益，消除兩頭都學不好的顧慮。

2.3 TGF-β1刺激對鼻上皮細胞緊密連接基因表達的影響

The dissipation due to charging and discharging capacitances Edyn can be calculated as

3 討論

鼻黏膜上皮細胞形成的緊密連接屏障是呼吸道重要的防御機制之一，既有效阻止了病原體及有害顆粒對上皮下組織的侵害，又可通過調節其對炎性反應細胞的透過性而參與炎性反應。鼻黏膜上皮屏障的破壞導致大量病原體、毒素及過敏原進入黏膜下組織，與多種疾病的發病相關，如特應性皮炎、支氣管哮喘、炎性腸病等[11-12]。本研究在體外細胞培養模型中評估了中國漢族人群鼻息肉患者上皮緊密連接屏障功能的改變，發現與健康對照上皮細胞相比，鼻息肉患者上皮細胞TER明顯降低，同時上皮細胞間對熒光素FITC-Dextran的通透性明顯增加，說明鼻息肉患者上皮屏障功能有明顯破壞，是CRSwNP發病相關因素之一。

圖1 TGF-β1對人鼻上皮細胞跨膜阻力和細胞間FITC-Dextran通透性的影響。Fig.1 Effect of TGF-β1 on human nasal epithelial transepithelial resistance(TER) and paracellular FITC-dextran flux

A： Comparison of baseline TER and paracellular FITC-Dextran flux in epithelial cells from healthy control subjects(n=10) and patients with CRSwNP(n=12) under resting conditions without any stimulation.*P<0.05vscontrol groups；B： Effects of TGF-β1 stimulation on TER in epithelial cells from control subjects(n=10) and patients with CRSwNP(n=12).#P<0.05vsu.s. group；C： Effects of TGF-β1 stimulation on paracellular FITC-Dextran flux in epithelial cells from control subjects(n=10) and patients with CRSwNP (n=12).#P<0.05vsu.s. group.TER：transepithelial resistance;u.s.:unstimulated;TGF-β1:transforming growth factor-β1;CRSwNP:chronic rhinosinusitis with nasal polyps.

圖2 TGF-β1對人鼻上皮細胞緊密連接蛋白表達的影響Fig.2 Effect of TGF-β1 on human nasal epithelial tight junction(TJ) protein expression

Representative immunofluorescence staining for occludin(A) and ZO-1(B) in epithelial cells from healthy control subjects(n=10) and patients with CRSwNP(n=12) in u.s. conditions and after 10 ng/mL TGF-β1 stimulation for 72 h.Arrowspoint out stratification of TJs. Bar=20 μm;u.s.:unstimulated;TGF-β1:transforming growth factor-β1;CRSwNP:chronic rhinosinusitis with nasal polyps.

圖3 TGF-β1對人鼻上皮細胞緊密連接基因mRNA表達的影響Fig.3 Effects of TGF-β1 on human nasal epithelial tight junction(TJ) mRNA expression

A： comparison of TJ mRNA expression in human nasal epithelial cells from control subjects(n=10) and patients with CRSwNP(n=12) in resting conditions without any stimulation；B： effects of 10 ng/mL TGF-β1 stimulation for 72 h on TJ mRNA expression in epithelial cells from control subjects(n=10)；C： effects of 10 ng/mL TGF-β1 stimulation for 72 h on TJ mRNA expression in epithelial cells from patients with CRSwNP(n=12).TGF-β1:transforming growth factor-β1;u.s.:unstimulated;CRSwNP:chronic rhinosinusitis with nasal polyps.

墾利油田群中某待開發油田A所產原油黏度較高，50℃下黏度為2700 mPa·s，擬采用依托周邊油田開發。選取周邊可能被依托開發的3個不同黏度梯隊的稀油油田原油(稱為稀油a、稀油b和稀油c)作為組分油。按照各油田產油量配比，分別與墾利油田A原油摻混，利用HAAKE MARS高溫高壓流變儀及配套溫控器對混合原油進行測量，各組分油黏溫特性如圖1～圖2所示。

鼻息肉患者具有不同的炎性表型，西方人群的鼻息肉患者多表現為Th2優勢應答和嗜酸性粒細胞浸潤，伴有IL-5等炎性因子升高；而亞洲人群鼻息肉患者則表現為混合性T細胞免疫反應和非嗜酸性炎性反應[13-15]。有文獻[6]提示不同人種的鼻息肉患者中上皮緊密連接屏障的調控機制也有所不同，比如在高加索人群中，炎性因子IFN-γ和IL-4調控鼻息肉的屏障功能，而在澳大利亞鼻息肉患者中，Th17細胞因子在鼻黏膜屏障破壞中發揮了重要的調控作用[16]。因此，本研究探討了中國漢族人群鼻息肉患者上皮屏障的調控機制，首次發現TGF-β1對人鼻上皮細胞緊密連接有重要的調控作用，其在健康對照及鼻息肉來源的上皮細胞上均可顯著破壞上皮緊密連接，導致細胞TER降低，細胞間熒光素通透增加，破壞緊密連接蛋白表達模式，說明TGF-β1在CRSwNP屏障功能破壞中發揮了重要的調控作用，或可作為治療干預的靶位點。

本研究結果中，在靜息狀態下鼻息肉來源的鼻上皮細胞TJ基因mRNA表達水平與健康對照上皮細胞相比，僅claudin-1 mRNA表達有升高趨勢；而在10 ng/mL TGF-β1刺激后，TJ基因mRNA表達較未刺激前也無明顯的變化，這與靜息狀態下息肉來源的上皮細胞TER明顯低于健康對照上皮，FITC-Dextran通透性高于對照上皮；而10 ng/mL TGF-β1刺激后，兩種來源的上皮細胞TER明顯降低，FITC-Dextran通透性增加，TJ表達蛋白模式明顯破壞結果不符。TJ相關基因在mRNA和蛋白水平表達不一致的原因尚不清楚，筆者推測是一個逆調節效應后果，但該結果也提示了CRSwNP上皮緊密連接屏障功能的非mRNA水平調控機制，具體的調控機制有待進一步的研究證實。

綜上所述，本研究證實在中國漢族人群的鼻息肉患者中，鼻上皮細胞緊密連接屏障功能有明顯破壞，是鼻息肉發病相關因素之一；而細胞因子TGF-β1在鼻息肉上皮緊密連接功能破壞中發揮了重要的調控作用，提示TGF-β1或可作為鼻息肉干預治療的靶位點。

[1] 中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志編輯委員會鼻科組. 中華醫學會耳鼻咽喉頭頸外科學分會鼻科學組. 慢性鼻-鼻竇炎診斷和治療指南(2012年，昆明)[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2013，48(2): 92-94.

[2] Chiba H， Osanai M， Mu