STR分型技術鑒定后兩株U87膠質瘤細胞系生物學特性評價

張文麗 孔凡虹 何 露 董成亞 王雅杰，3*

(1.首都醫科大學附屬北京天壇醫院檢驗科，北京 100050；2.首都醫科大學附屬北京天壇醫院臨床醫學研究實驗室，北京 100050；2.首都醫科大學附屬北京天壇醫院臨床醫學研究實驗室，北京 100050；3. 首都醫科大學附屬北京地壇醫院檢驗科，北京 100015)

腦膠質瘤是一種顱內最常見的惡性腫瘤，特別是膠質母細胞瘤，惡性程度最高，呈浸潤性生長，預后最差，對多種治療方案具有高耐受性[1-4]。膠質瘤細胞的增生、遷移和侵襲造成膠質瘤的浸潤性生長，難以與周圍組織分清界限，并侵襲重要神經血管，在腫瘤的進展中發揮重要作用[5]。U87細胞系是惡性膠質瘤細胞系，廣泛應用于膠質瘤的科學研究中[6]。

美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection， ATCC) 和美國國立衛生研究院(National Institutes of Health， NIH)等機構建立在實驗前對所使用細胞系進行準確鑒定[7-8]。在本課題組[9]前期研究中，利用人類細胞系鑒定金標準——短串聯重復序列(short tandem repeats，STR)分型檢測技術對實驗室現有的3株U87細胞系進行了鑒定，篩選出2株真正的U87膠質瘤細胞系，分別為ATCC數據庫中U-87MG Glioblastoma-Astrocytoma Human細胞、德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ)數據庫中U-87MG細胞，兩細胞株未出現污染現象，細胞株來源的患者性別不同，其他用于鑒定的STR位點一致[10]。然而，兩株U87膠質瘤細胞系生物學特性以及是否能夠應用于后續的科研實驗尚未確定。

本研究采用CCK-8法、劃痕實驗、Transwell實驗等方法，對兩細胞系進行細胞生物學特性的比較。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1)腦膠質瘤細胞系：U87-A：ATCC數據庫中U-87 MG Glioblastoma-Astrocytoma Human；U87-D：DSMZ數據庫中U-87 MG。

2)儀器設備：多氣體培養箱(型號MAO-18M，日本三洋公司)，離心機(型號DZ47-63，北京白洋醫療器械有限公司)，ESCO OptiMair?垂直流超凈工作臺(型號ACB-4A1，新加坡ESCO公司)，倒置顯微鏡(型號Axiovert 40，德國ZEISS公司)，多功能酶標儀(型號SpectraMax M5，美國Molecular Devices公司)。

3)主要試劑：DMEM、胎牛血清(美國Gibco公司)，0.25%(質量分數)胰蛋白酶、PBS緩沖液(美國Hyclone公司)，CCK-8試劑(日本同仁化學)，Transwell小室(美國Costar公司)，Matrigel膠(美國 BD公司)。

1.2 細胞生長特性以及形態特征觀察

分別復蘇1支U87-A、U87-D凍存細胞于T25培養瓶中，做好標記，使用含10%(體積分數)胎牛血清的DMEM培養基，5%CO2(體積分數)、37 ℃培養箱中培養。細胞培養過程中使用倒置顯微鏡觀察細胞的一般形態及生長速度。復蘇后24 h及培養72 h拍照。實驗重復3次。

1.3 細胞生長曲線(CCK-8法)

取對數生長期細胞，用DMEM培養基制成2.5×104/mL單細胞懸液，接種至96孔板中(100 μL/孔，即2.5×103個細胞/孔)，將培養板放在培養箱中預培養[37 ℃、5%(體積分數) CO2]。培養6、24、48、72 h，每個時間段5個重復，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養板繼續在培養箱內孵育1～4 h后，用酶標儀測定450 nm處的吸光度。實驗重復3次，取平均值。以時間為橫坐標，A值為縱坐標擬合細胞生長曲線。

1.4 劃痕實驗

先用Marker筆在6孔板背后，均勻劃橫線，大約每隔0.5～1.0 cm劃一道，橫穿過孔。在孔中加入約1×106個細胞，待細胞鋪滿時，用槍頭盡量垂直于背后的橫線劃痕。用PBS洗滌細胞，去除劃下的細胞，加入無血清培養基。繼續放入37 ℃、5%(體積分數)CO2培養箱培養。劃痕后0 h和繼續培養24 h后拍照。設3個重復孔，實驗重復3次。結果用遷移率表示，遷移率=(劃痕0 h距離-劃痕24 h后距離)/劃痕0 h距離。

1.5 Transwell遷移、侵襲實驗

1)遷移實驗：取對數生長期細胞，用無血清DMEM培養基將細胞密度稀釋為5×104個/mL。在Transwell小室的內室加入100 μL的上述細胞混懸液，外室內加入600 μL含20%(體積分數)血清的DMEM培養基，置于37 ℃、5%(體積分數)CO2培養箱中培養。24 h后終止培養，棄去外室的培養液，PBS洗滌后，用4%(質量分數)多聚甲醛固定細胞約20 min，0.1%(質量分數)結晶紫常溫染色30 min。棄去內室液體，PBS洗2遍，用棉簽輕輕擦拭內室上室面的細胞。風干后置于顯微鏡下，每個小室隨機選取3個視野拍照，計數穿到下室的細胞數量，取均值，以遷移細胞的相對數目來表示腫瘤細胞的遷移能力。設3個平行小室，實驗重復3次。

2)侵襲實驗：將50 mg/L Matrigel用無血清DMEM培養基將其按1∶8比例稀釋混勻，取40μL包被Transwell小室底部膜的上室面，置于37 ℃、5%(體積分數)CO2培養箱中，2 h后待用，待Matrigel膠凝為膠狀時可開始加樣。其他步驟同遷移實驗。設3個平行小室，實驗重復3次。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 細胞生長特性以及形態特征

U87-A與U87-D細胞生長特性以及形態特征較為相似，兩細胞系均為貼壁型，細胞多呈扁平不規則形，中間有圓形細胞核，細胞彼此緊密相連成單層，有長短不一的突起。復蘇約2 d后生長呈網狀，3～4 d可傳代。經液氮或-150 ℃低溫凍存后復蘇仍能繼續增生，顯微鏡下形態見圖1。

圖1 兩細胞系顯微鏡下形態Fig.1 Microscope morphology of the two cell lines

A：morphology of U87-A after 24 h recovery；B：morphology of U87-A after 72 h recovery;C:morphology of U87-D after 24 h recovery；D：morphology of U87-D after 72 h recovery.

2.2 細胞生長曲線

CCK-8法檢測細胞的生長增生能力，結果提示U87-A在4個時間點吸光度值分別為：0.395±0.009、0.878±0.027、1.949±0.127、2.192±0.085，U87-D在4個時間點吸光度值分別為：0.397±0.006、0.777±0.022、1.748±0.081、1.909±0.086。細胞生長曲線顯示U87-A較U87-D生長速度稍快，但差異無統計學意義(P>0.05)。兩株細胞連續培養72 h，均達到對數生長期且生長良好，可用于進一步實驗(圖2)。

2.3 劃痕實驗

劃痕實驗檢測細胞的遷移能力，結果提示U87-A和U87-D細胞劃痕24 h后細胞遷移率分別為 0.42±0.05、0.39±0.03，差異無統計學意義(P>0.05，圖3)。

圖2 細胞生長曲線Fig.2 Cell growth curve

圖3 劃痕實驗檢測細胞遷移能力Fig.3 Migration ability of cell detected by scratch test(40×)

A：0 h after the U87-A scratch test；B：24 h after the U87-A scratch test；C：0 h after the U87-D scratch test；D：24 h after the U87-D scratch test.

2.4 Transwell實驗

U87-A和U87-D細胞遷移到下室的細胞數分別為269.33±17.39、239.00±13.74，差異無統計學意義(P>0.05,圖4)。

U87-A和U87-D細胞侵襲到下室的細胞數分別為182.33±8.74、214.00±13.53，差異具有統計學意義(P<0.05)，U87-D細胞侵襲能力高于U87-A細胞(圖5)。

圖4 Transwell實驗檢測細胞遷移能力Fig.4 Migration ability of cell detected by Transwell assay(100×)A：Cells of U87-A cell line were migrated to the lower chamber；B：Cells of U87-D cell line were migrated to the lower chamber.

圖5 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力Fig.5 Invasion ability of cell was detected by Transwell assay(100×)A：Cells of U87-A cell line were invaded to the lower chamber；B：Cells of U87-D cell line were invaded to the lower chamber.

3 討論

科研實驗中對細胞系進行質量控制，去除錯誤和發生交叉污染的細胞，能夠保證后續研究的準確性[7，11]。在本課題組[9]前期研究中，利用STR分型檢測技術篩選出了兩株U87膠質瘤細胞系，但對于兩細胞系生物學特性了解甚少。進行實驗前，了解使用細胞系的生物學特性對實驗的成敗同樣至關重要。

腫瘤細胞與體內正常細胞相比，在形態、生長增生、遷移以及侵襲等方面具有顯著不同。其在體內和體外培養均表現為不受控增生性，具有無限的復制能力，在低血清中仍能生長。腫瘤細胞的遷移和侵襲能力造成了腫瘤組織的浸潤和轉移，并能促進血管生成[12-13]。

本研究利用體外細胞培養方法，采用各種細胞學實驗，并結合顯微鏡下形態學特征，評價兩U87細胞系的生物學特性。兩細胞系復蘇后生長良好，均可用于進一步實驗，顯微鏡下無明顯形態學差異。CCK-8增生實驗未發現細胞增生能力的差異，劃痕實驗結果提示兩細胞系遷移能力差異無統計學意義(P>0.05)，后通過Transwell實驗驗證其遷移能力，結果同劃痕實驗。而Transwell侵襲實驗顯示U87-D細胞侵襲能力高于U87-A。綜上所述，兩細胞系在形態學、生長增生及遷移能力方面差異無統計學意義(P>0.05)，僅侵襲能力方面差異有統計學意義(P<0.05)。

U87細胞系能夠反應腦膠質瘤的生物學特性，目前已廣泛應用于膠質瘤的研究[14]中，對膠質瘤發生、發展各項機制的研究具有重要意義。本研究著眼于細胞應用的實際需求，通過評價兩U87細胞系的生物學特性，對其各個方面有了更好的了解，對于細胞系的后續應用具有重要價值。為相關領域的研究提供了選擇細胞系的實驗依據，可根據不同的實驗目的選擇合適的細胞系，有助于后續研究的順利開展。

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