黃酒中高級醇含量控制與檢測研究進展

黃桂東,吳子鎣,唐素婷,馮結鏵,鐘先鋒*

(1.佛山科學技術學院 食品與科學工程學院,廣東 佛山 528200；2.廣東省傳統發酵食品工程技術研究中心,廣東 佛山 528200；3.廣東省食品流通安全控制工程技術研究中心,廣東 佛山 528200；4.佛山市釀造工程技術研究中心,廣東 佛山 528200)

黃酒作為中華民族的瑰寶,經過幾千年的發展,已經成為具有中國特色的酒類和具有發展潛力的酒種。黃酒是以大米、黍米為主要原料,利用酒藥、麥曲或米曲所含的多種微生物共同作用釀制而成的發酵酒,與啤酒、葡萄酒并稱世界三大古酒[1-3]。作為一種傳統的酒精飲料,黃酒以其獨特的風味和較高的營養價值而廣受歡迎[4],被譽為“液體蛋糕”,其保健功能以及營養價值被人們漸漸熟知。研究表明[5],黃酒具有增強記憶能力、增強免疫能力、預防骨質疏松等多種保健功能,為人們所喜愛,因此,黃酒的消費群體正在逐漸擴大。

高級醇是指含3個以上碳原子醇類的總稱,俗稱雜醇油,是酒類發酵過程中產生的主要副產物,也是酒類主要香味和口味物質之一。黃酒中的高級醇主要有異丙醇、烯丙醇、正丙醇、異丁醇、正丁醇、叔丁醇、異戊醇、正戊醇、苯甲醇、β-苯乙醇等[6]。適量的高級醇賦予黃酒特有的醇香、豐滿圓潤和協調的口感,但高級醇的含量過高,就會產生異雜味和較強的致醉性,俗稱“上頭”[7]。因此,解決黃酒較強的致醉性、賦予黃酒豐滿的口感、增加酒體的協調性等問題迫在眉睫。而這些問題均與黃酒中的高級醇有著不同程度上的聯系,故而研究黃酒中高級醇的代謝途徑、控制黃酒高級醇含量的策略、影響因素和檢測方法是十分必要的。因此,本文對黃酒釀造過程中高級醇的主要代謝途徑、釀造工藝對高級醇的影響及其含量的檢測方法進行了探討,以期為控制黃酒中高級醇含量提供參考。

1 黃酒中高級醇的代謝途徑

發酵過程中酵母產生的高級醇是影響黃酒品質的重要因素之一[6]。高級醇主要來自于氨基酸的降解代謝和葡萄糖的合成代謝。在黃酒發酵過程中,隨著酒精濃度的逐漸升高,部分酵母菌和部分乳酸桿菌自溶,伴隨著大量氨基酸和多肽產生[8]。同時,氨基酸也是酵母發酵代謝的產物之一。因此,在黃酒的發酵過程中,氨基酸量多且種類豐富,從而間接導致高級醇的量大大增加,這就是黃酒高級醇含量比其他釀造酒中高級醇含量高的主要原因。

1.1 氨基酸降解途徑產生高級醇

1907年,德國化學家艾利希爾提出高級醇是氨基酸脫氨氧化形成的。他認為亮氨酸和異亮氨酸通過水合酶的作用生成異戊醇和活性戊醇[9]。在其后的50年中,經過人們的不斷探索發現:酒精發酵過程中,在微生物內通過Ehrlich途徑代謝氨基酸,形成高級醇[10-11],氨基酸先經過轉氨作用生成酮酸,再被還原脫羧生成比原氨基酸少一個碳原子的相應的高級醇,即Ehrlich途徑[5](見圖1)。常見的氨基酸對應的高級醇如圖2所示。

圖1 氨基酸和葡萄糖降解代謝高級醇的Ehrlich途徑和Harris途徑Fig.1 Ehrlich pathway and Harris pathway of amino acids and glucose degradation and metabolism of higher alcohols

圖2 常見氨基酸代謝的高級醇Fig.2 Higher alcohols of common amino acid metabolism

1.2 葡萄糖合成途徑產生高級醇

1953年,HARRIS提出的高級醇的合成通過丙酮酸代謝途徑[12]。1958年,THOUKI也提出了高級醇可以直接從葡萄糖的形成[5]。近年來,也有學者研究了高級醇由糖代謝通過丙酮酸脫羧后氧化而成的合成途徑。該說法認為:在發酵過程中,由糖類提供氨基酸的生物合成骨架,在反應的中間階段生成α-酮酸,并由此還原脫羧形成相應的高級醇[5](見圖1)。該途徑與發酵過程中酵母的糖代謝息息相關(見圖3)。可見氨基酸是高級醇的主要前體物。因此,在發酵期間,氨基酸含量的多少是影響黃酒高級醇含量的主要因素之一。

圖3 糖-氨基酸-高級醇代謝過程Fig.3 Metabolic process of glucose-amino acids-higher alcohols

2 影響黃酒高級醇含量的工藝因素

研究表明[13],在黃酒發酵過程中,生產原料、糖化劑、酵母和發酵溫度等是影響高級醇含量的主要工藝因素。浙江工商大學蔣予箭教授團隊主要是通過提高大米精白度[12]、改良酵母[5]、新舊工藝的實施[14]、先糖化后發酵工藝[15]、糖化劑的應用[16]來降低黃酒高級醇含量,取得了一定效果,經各改良策略實施后,降低了高級醇含量。

2.1 生產原料

黃酒生產原料有糯米、粳米、小麥、玉米、高粱等,不同品種的原料,其蛋白質含量各不相同,從而氨基酸由Ehrlich途徑所生成的高級醇含量不同[5]。選用蛋白質含量低的原料,可減少黃酒中高級醇的含量。陳雙等[17]研究表明,高粱、玉米發酵液中β-苯乙醇含量要高出糯米發酵液2倍多,這與其研究的高粱、玉米原料中的苯丙氨酸含量明顯高于糯米原料的結果相吻合。榮智興等[12]研究了不同精白度大米對黃酒主發酵階段高級醇含量的影響,采用精米率分別為100%、90%、86%和80%的4種不同精白度大米釀造黃酒,主發酵結束后,樣品高級醇總量分別為311.0 mg/L、391.1 mg/L、311.4 mg/L和259.9 mg/L,高級醇與乙醇的比值分別為5.20×10-5、4.43×10-5、3.89×10-5和3.60×10-5。表明精白度越高,黃酒的高級醇與乙醇的比值越低。經不同品種原料發酵釀造的黃酒,其高級醇含量不同,以高粱和玉米為原料釀制的黃酒高級醇含量比以糯米為原料的高；另外,以大米為原料時,大米精白度越高,黃酒的高級醇與乙醇的比值越低。

2.2 糖化劑

黃酒釀造的糖化劑主要是麥曲,在現代機械化生產黃酒中常采用生麥曲與熟麥曲混合使用的方式。釀酒酵母不產胞外酸性蛋白酶和酸性羧肽酶,故蛋白質主要被曲中的酸性蛋白酶和酸性羧肽酶降解,形成氨基酸,因此曲中這兩種酶的多少對黃酒中高級醇的含量影響很大[18]。張興亞等[14]研究了不同濃度的麥曲糖化發酵劑對黃酒中高級醇含量的影響,結果表明,當麥曲濃度從8%降至4%時,高級醇含量從489.1 mg/L降低至230.4 mg/L。龔耀平[19]研究了不同麥曲對黃酒中高級醇含量的影響,結果表明,生麥曲添加量從0增加到20 kg時,高級醇的含量從518.25 mg/L降至338.82 mg/L；熟麥曲添加量從3 kg增至25 kg時,高級醇含量在5 kg時最低,為301.32 mg/L。因此,降低麥曲糖化劑濃度和選用適當量的生、熟麥曲可以降低黃酒中高級醇的含量。

2.3 發酵溫度

高品質黃酒的生產在很大程度上取決于發酵溫度[20]。溫度是酒釀造過程中酵母參與生化反應的重要外界因素,是諸多因素中最重要的條件之一。在發酵過程中,溫度是決定黃酒質量的關鍵參數[21]。改變發酵溫度會對酵母的生命活動造成一定程度的影響,從而影響酒中高級醇種類和含量及各高級醇之間的平衡。毛青鐘[22]研究了不同發酵溫度對黃酒質量的影響,結果表明,后酵溫度低,有利于酵母的發酵作用,高級醇生成量較多；后發酵溫度高,有利于細菌(如乳酸桿菌)的發酵作用,高級醇生成量較少。根據張興亞[23]研究的不同發酵溫度對黃酒中高級醇含量的影響表明,對于前發酵溫度,當溫度低于30℃時,高級醇含量隨著溫度的升高而升高,當溫度高于30℃時,高級醇含量隨著溫度的升高而降低,但是高于34℃時黃酒有酸敗現象；對于后發酵溫度,高級醇含量隨著溫度升高而升高。

2.4 酵母的種類

高級醇是酵母合成細胞蛋白質時的副產物,而不同的酵母菌株有著各自不同的生理特性,因此在相同條件下生成的高級醇含量也存在差異。不同的酵母菌種生成高級醇的差別是很大的,可通過選育高級醇產量低的菌株、修飾氨基酸的不同透性酶基因等方法來降低發酵過程中高級醇的產量[24]。方維明等[25]研究了低含量高級醇啤酒酵母菌株的選育,將酵母經紫外燈照射誘變后,依次通過乳酸、麥芽汁-碳酸鈣和氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)上層平板篩選,分離獲得一株高級醇產量與未經紫外燈照射處理的酵母相比下降28.7%的目標菌株,使啤酒中高級醇含量由98.4 mg/L降至70.2 mg/L。楊魯君等[26]研究了不同的黃酒酵母菌株對黃酒發酵過程中高級醇含量的影響,結果表明,不同的黃酒酵母菌株釀造成的黃酒中,其高級醇含量存在差異。YOSHIMOTO H等[27]對α-丙酮酸脫羧酶基因PDC1進行了研究,構建了相應的缺失突變株,結果顯示異戊醇的濃度下降了31%。

除了生產原料、糖化劑、發酵溫度和酵母的種類這4種因素之外,不同的釀造工藝、料水比、浸米時間、酵母接種量及增值倍數、酵母菌種同化氨基酸的能力等因素均在不同程度上影響著黃酒中的高級醇含量。龔耀平等[15]研究了先糖化后發酵的工藝對黃酒高級醇含量的影響,結果表明,在糖化后發酵工藝酒樣中,后酵結束時高級醇含量為329.3 mg/L,低于雙邊發酵工藝(399.5 mg/L),因此,先糖化后發酵有利于降低高級醇的含量。

3 控制黃酒高級醇含量的策略

在釀酒酵母細胞中,高級醇合成受發酵體系中氮素營養狀況調控[28]。氮素營養充足時,氨基酸經細胞質支鏈氨基酸轉氨酶(cytosolicbranched-chainaminoacidaminotransferase,BCAT)作用脫氨生成α-酮酸,進一步在α-酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶作用下,生成高級醇[29]。該反應過程需要三羧酸循環(tricarboxylic acid cycle,TCA)提供氨基受體α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)；氮素營養缺乏時,高級醇生成受酮酸溢出機制調控。氮源的耗盡觸發糖酵解途徑(又稱EMP途徑)關鍵酶(如磷酸果糖激酶、己糖激酶等)誘導表達,葡萄糖代謝活躍,生成大量的丙酮酸,丙酮酸經異構、脫氫、脫羧等反應生成α-酮酸,最后生成高級醇[30]。

根據高級醇與氮素營養的關系,并結合其合成途徑,研究人員試圖通過氮素補償或氮素缺失策略降低酒中高級醇含量[12,31]。氮素是酵母細胞生長和代謝必不可少的元素,但并非所有的含氮物質都能被酵母用于細胞代謝途徑。能被酵母利用的含氮物質稱為酵母菌可同化氮(yeast assimilable nitrogen,YAN),主要包括:α-氨基酸(脯氨酸除外)、小分子的多肽和銨態氮[32]。研究表明[33],不同氮源的同化代謝是有序的,當培養基中同時存在多種氮源時,釀酒酵母通過氮代謝阻遏機制(nitrogencatabolite repression,NCR)優先選擇更好的氮源[34]。釀酒酵母對不同氮源利用的先后順序為:天冬氨酸、谷氨酰胺＞銨鹽＞谷氨酸＞纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸＞脯氨酸、精氨酸[35]。氨基酸是高級醇的前體物質,降低氨基酸的含量勢必會導致高級醇含量的降低。因此,大量研究側重于氮素缺失策略,試圖通過降低氨基酸的含量或阻斷氨基酸代謝,進而降低高級醇含量。但對于復雜的黃酒發酵體系而言,在發酵初期(約1～2 d),YAN相對充足,其被快速利用,細胞經過氨基酸分解途徑(Ehrlich途徑)產生高級醇,這時產生的高級醇約占總高級醇含量的25%。而在發酵中后期(約2～20 d),盡管釀酒體系含有豐富的蛋白質和多肽,但由于酵母細胞幾乎不向胞外分泌蛋白酶,故而酵母利用大分子有機氮源的能力很弱,導致了發酵過程中氮素相對缺乏,而碳源仍相對充足,在此條件下,細胞內經過生化合成途徑(Harris代謝),大量合成高級醇,約75%的高級醇主要通過Harris代謝途徑轉化而來[36]。因此,通過氮素補償策略,使黃酒發酵體系中有充足的YAN,此時,酵母主要由氨基酸途徑(Ehrlich途徑)進行發酵代謝,從而降低高級醇的生成量,因此氮素補償策略能有望成為降低黃酒中高級醇含量的主要研究方向。通過添加銨鹽可實現氮素補償。傅紅雪[37]通過向酵母發酵釀造而成的酒中添加345 mg/L磷酸氫銨和0.336 mg/L硫胺素,結果表明,與未添加銨鹽的對照組相比,高級醇含量從281.64 mg/L降至175.28 mg/L。銨鹽來源易得、價格低廉,且可被酵母高效轉運及快速同化,成為工業化釀酒體系中潛在的氮源補償劑。

4 黃酒中高級醇含量的檢測方法

4.1 分光光度法

分光光度法是最早用來測定黃酒高級醇含量的方法。根據高級醇(正丙醇除外)經濃硫酸脫水后,轉化為不飽和烴,與對二甲氨基苯甲醛發生縮合反應,生成橙黃色化合物的原理來測定[38],該法的優點在于操作簡單,在設備條件有限的情況下,仍可以檢測產品中的高級醇含量,但此方法只能檢測黃酒中高級醇總含量,不能測定各不同組分的高級醇含量。杜威等[38]運用分光光度法檢測了黃酒中的高級醇含量。因此,可用分光光度法來測定黃酒中高級醇的含量,但仍存在一些問題有待解決,如試劑的濃度和用量、如何消除黃酒本身帶來的色差等。

4.2 氣相色譜法

相較于分光光度法難以實現及時、快速測定和不能測定單一組分等缺陷,氣相色譜有著獨特的優勢,可以迅速、敏捷和測定各組分高級醇的含量。氣相色譜法分為內標法和外標法,內標法是通過對待測定高級醇含量的黃酒樣品中添加高級醇標準品,以提高分析結果的準確度；外標法是通過利用高級醇標準品與待測樣品作對照以提高定量分析的準確性。黃建明等[39]采用毛細管氣相色譜法,以峰面積外標法定量測定黃酒中的高級醇,測得的相對標準偏差為0.01%～1.03%,因此該法精密度好,準確度高。尹桂豪等[40]用毛細管氣相色譜法對黃酒中β-苯乙醇進行了檢測,但在檢測前,用正己烷對黃酒中的β-苯乙醇進行了萃取,防止了黃酒中的糖類和色素進入色譜體系,避免樣品中β-苯乙醇對檢測結果的干擾,縮短了檢測時間。氣相色譜是目前檢測黃酒中高級醇較為普遍的方法,但氣相色譜的儀器貴重,運行及維修費用均較高,不適在生產過程中快速檢測高級醇。

4.3 其他方法

4.3.1 頂空固相微萃取-氣相色譜質譜法

肖昭競等[41-42]研究表明,高級醇還可用頂空固相微萃取-氣相色譜質譜的方法進行測定,萃取溫度和萃取時間為40℃和30 min,定量方法采用面積歸一法,該分析方法快速簡單,無干擾。另外,固相微萃取技術不需要使用有毒的有機溶劑,檢測界限低,一步實現分析物的提取、濃縮,并具有良好的線性相關性；該方法還具有很高的靈敏度,曾詩雨等[43]使用該法進行酒釀中乙醇測定,檢測限為11.92μg/g,但也有操作復雜、耗時長、需消耗大量的吹掃氣體(氮氣)和捕集材料等缺點,該方法不適用于在實際生產中快速檢測高級醇。

4.3.2 薄層層析法

利用高級醇可顯色的特性,本團隊擬探索建立一種檢測高級醇的方法—薄層層析法。相較于其他方法,薄層層析不借助任何設備,僅利用實驗室常見的儀器和試劑即可半定量的檢測黃酒中不同種類高級醇的含量,測定結果分離速度快、靈敏度和分辨率都較高[44]。薄層層析操作方便,測定成本低,可應用于生產實踐中,十分具有商業開發價值。但目前,針對用薄層層析方法檢測高級醇具體所要使用的展開劑、顯色劑以及相關細節仍在研究當中,若該法在實驗室可行并得到可靠的結果,即可在生產中付諸于實踐,便于在生產過程中,簡單快速的檢測高級醇。

5 結論

黃酒作為一種古老的釀造酒,已被人們飲用上千年,其中含有的高級醇可增強飲用的口感,但會致醉,因此,研究黃酒中高級醇對提高黃酒品質有重要意義。黃酒中的高級醇由兩條途徑合成,分別是以葡萄糖為原料的Harris途徑和以氨基酸為原料的Ehrlich途徑；在釀造過程中生產原料的種類、糖化劑的使用情況、酵母的種類和發酵溫度都會影響高級醇的含量,通過控制以上工藝條件可降低黃酒中高級醇含量,此外,亦可通過氮素補償策略或氮素缺失策略降低黃酒中高級醇含量；對于黃酒中高級醇含量可通過分光光度法、氣相色譜法、頂空固相微萃取-氣相色譜質譜進行含量的測定。另外,本團隊擬探索建立薄層層析法測定黃酒中高級醇的含量,該法操作簡便,成本低,用于生產實踐過程中,具有商業開發價值。在生產實踐過程中,如何通過控制工藝條件來控制高級醇的代謝以及在如何檢測黃酒中的高級醇含量,將會是日后的研究方向,對黃酒的生產實踐也具有重要的指導意義。

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