郫縣豆瓣加工過程中黃曲霉毒素B1的變化及關鍵控制點研究

張 帥,馬秀靈,李 恒,4,陳 功,4,楊國華,李潔芝,李 峰,黃 靜,張其圣,4*,游敬剛,陳相杰

(1.四川省食品發酵工業研究設計院,四川 溫江 611130；2.成都中醫藥大學,四川 溫江 611137；3.四川省丹丹郫縣豆瓣集團股份有限公司,四川 成都 611732；4.四川東坡中國泡菜產業技術研究院,四川 眉山 620000)

黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉在生長過程中的一類次級代謝產物[1-2],已被世界衛生組織列為最強化學致癌物質之一[3-4]。目前,已分離鑒別出的黃曲霉毒素共有20多種,其中黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是毒性最強且致癌性最大的一種。近年來,隨著我國食品行業的不斷創新與發展,豆瓣產業也隨之呈現穩固上升的趨勢,然而開放式的豆瓣制作環境[5-6]和復雜繁長的制作工序也使得豆瓣在生產加工過程中存在某些食品安全隱患。過去的研究表明,AFB1是豆瓣加工過程中最主要的問題之一。

由于豆瓣生產中所用米曲霉與黃曲霉的生長條件相近,生產控制不嚴很容易造成雜菌污染并產生黃曲霉毒素[7]。同時,還有很多關于豆瓣加工過程中黃曲霉毒素污染的原因及其控制的研究[8]。在制曲過程中,徐坤等[7]利用響應面法優化得到豆瓣的最佳制曲工藝,并控制了豆瓣醬中AFB1的含量。在辣椒醅發酵過程中,徐洲等[9]通過對辣椒原料中AFB1含量的測定及防控措施進行了探討,得出辣椒醅是導致豆瓣產生AFB1的原因及辣椒醅中優勢菌群為乳酸菌的結論。徐進等[10]利用乳酸菌能影響黃曲霉的生長及產毒,使得生物學脫毒法在降低豆瓣中AFB1的含量方面得到了應用。在豆瓣發酵過程中,汪先丁等[11]研究了郫縣豆瓣在自然發酵過程中真菌群落的演替與黃曲霉毒素B1消長的關系。此外,關統偉等[12]探討了郫縣豆瓣在不同發酵期細菌群落結構及其動態的演替,趙紅宇等[13-14]對豆瓣后發酵期細菌多樣性和真菌演替變化的研究,劉春鳳等[15]對成熟期豆瓣醬醅中的微生物群落分析都為豆瓣發酵過程中AFB1消長的原因提供了依據。然而,國內外基于生產過程來系統研究發酵過程中黃曲霉毒素B1的變化還少有報道。因此,本實驗基于郫縣豆瓣的加工過程,對其各個關鍵工藝點進行AFB1的測定,同時按照豆瓣的制作工藝,在實驗室模擬工廠的生產流程制作豆瓣,并進行AFB1含量的測定,以期為豆瓣制作過程中控制黃曲霉毒素的產生和建立關鍵控制點提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

制曲期、辣椒醅發酵期、豆瓣成熟期和后熟期各時間段樣本:采集于郫縣丹丹豆瓣廠；甲醇(分析純):成都市科龍化工試劑廠；黃曲霉毒素B1酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒:北京華安麥科生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

ST-360酶標儀:上海科華實驗系統有限公司；TDL-40B低速臺式離心機:上海安亭科學儀器廠；THZ-C-1全溫振蕩器:蘇州培英實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 郫縣豆瓣生產工藝流程及操作要點

(1)干蠶豆瓣在沸水中漂燙3～5 min后冷卻至室溫,加入25%的面粉和0.05%的曲種拌勻(以混合干料計)；30℃條件下制曲48h,32%鹽水拌曲,保溫發酵6～8月得到甜瓣子。

(2)新鮮辣椒剁碎,加15%鹽水鹽漬,發酵6個月得到辣椒醅。

(3)65%辣椒醅和35%甜瓣子配兌混合(g∶g),適當補鹽,通過“翻、曬、露”6個月得到成熟郫縣豆瓣。

1.3.2 AFB1測定方法

按照GB 5009.22—2016《食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》方法進行測定[16]。

2 結果與分析

2.1 制曲過程中AFB1含量的變化

制曲作為豆瓣加工過程中的首要環節,探究該階段AFB1的變化對于控制其在豆瓣中的含量十分重要。通過隨機選取豆瓣廠中兩個制曲曲房,從制曲起到制曲結束共48 h進行動態跟蹤取樣,每次兩個平行,得到AFB1在該階段的含量及變化趨勢。測定結果如圖1所示。

圖1 制曲過程中黃曲霉毒素B1含量的變化Fig.1 Change of aflatoxin B1content during koji making

由圖1可知,制曲過程中AFB1含量總體偏低,保持在0～0.25 μg/kg范圍內,這與汪先丁等[11]所報道自然發酵條件下豆瓣醬制曲階段的AFB1含量為2.097 μg/kg存在差異,其原因或與近年來大多豆瓣廠改用純種發酵有關。同時,AFB1含量在制曲前期最少,表現在制曲時間為0～40 h時AFB1基本無法檢出；在40 h后至出曲階段AFB1的含量有所升高,但整體幅度不大。因此可認為制曲階段對于豆瓣中AFB1含量的影響不大,不是郫縣豆瓣加工過程中形成AFB1的關鍵控制點。

2.2 甜瓣子發酵過程中AFB1含量的變化

通過記錄工廠內所有曲池里甜瓣子的發酵時間,再以發酵時間由短至長進行排序,每個時間段選出至少兩個曲池進行取樣,以探求甜瓣子發酵對豆瓣加工過程中AFB1含量變化的影響,測定結果如圖2所示。

圖2 甜瓣子發酵不同時期黃曲霉毒素B1含量的變化Fig.2 Change of aflatoxin B1content during different periods of sweet bean fermentation

由圖2可知,在發酵1～8個月內甜瓣子的AFB1含量呈明顯上升趨勢,即從發酵1個月時的0.18 μg/kg增加至發酵8個月時的1.09 μg/kg。同時,圖2中各時間點對應的AFB1值未呈現線性變化的原因可能是由于本試驗的取樣并不是基于動態跟蹤,而是根據生產線的實際情況來選取的,但試驗結果呈現一定的規律性則表明工廠加工豆瓣醬的工藝是較為穩定的,且造成甜瓣子在發酵過程中AFB1含量上升的原因比較固定。綜上可知甜瓣子的發酵時間是郫縣豆瓣加工過程中形成AFB1的關鍵控制點之一。

2.3 辣椒醅發酵過程中AFB1含量的變化

由于受豆瓣加工工藝的限制,對辣椒醅發酵過程中AFB1含量變化只能通過剛剁碎的辣椒與發酵成熟的辣椒醅(6個月)來進行研究。樣品測定結果如圖3所示。

圖3 辣椒醅發酵不同時期黃曲霉毒素B1含量的變化Fig.3 Change of aflatoxin B1content during different periods of pepper grains fermentation

由圖3可知,辣椒醅在發酵0月到6月的AFB1含量有所降低,從1.25μg/kg減至0.80μg/kg。由于大部分的AFB1是由黃曲霉代謝產生的,表明在辣椒醅發酵過程中黃曲霉的生長受到部分抑制,因此適當延長辣椒醅的發酵時間有助于減少豆瓣中的AFB1含量。同時也可推知在辣椒醅發酵階段的AFB1污染主要來源于原料。表明辣醅發酵時間和辣椒原料是控制郫縣豆瓣中AFB1含量的關鍵點。

2.4 豆瓣后熟期AFB1含量的變化

在豆瓣發酵后熟期,通過選取發酵時間為1、2、3、4、5和6個月時間段的豆瓣醬,來研究不同豆瓣醬發酵時間對其AFB1含量的影響。每個時間段取兩個曲池樣本,測定結果如圖4所示。

圖4 豆瓣醬后熟期黃曲霉毒素B1含量的變化Fig.4 Change of aflatoxin B1content during post-ripening period of bean paste

由圖4可知,豆瓣醬AFB1含量在其發酵過程中呈動態變化趨勢,總體含量為0.90～2.63 μg/kg,低于國家對發酵調味品的最新限量標準(5 μg/kg)[17]。在發酵時間為1～3月時,豆瓣醬中AFB1含量呈上升趨勢；3～6月時,AFB1含量有所下降,且在發酵4個月后保持穩定。表明豆瓣醬在發酵一定的年份后,其AFB1含量整體趨于穩定且總體低于國家限量標準,但該階段與成熟甜瓣子和辣椒醅中的AFB1含量相比,其AFB1含量上升明顯,究其原因可能是由于豆瓣醬加工工藝中的“翻、曬、露”過程導致空氣中雜菌混入豆瓣醬的發酵過程中。因此豆瓣醬的發酵時間和發酵環境是控制郫縣豆瓣中AFB1含量的關鍵點。

2.5 豆瓣加工過程中的關鍵控制點研究

為了進一步明確豆瓣加工過程中影響AFB1含量的關鍵點,在實驗室模擬工廠的豆瓣加工工藝,并依次選取豆瓣制作過程中的成曲、成熟甜瓣子(該階段發酵6個月)、成熟辣椒醅(該階段發酵6個月)和成品豆瓣醬(該階段發酵3個月)四個不同階段的樣本進行AFB1含量測定,旨在探究整個豆瓣醬制作過程中控制AFB1含量的主要環節。

圖5 豆瓣醬發酵過程中黃曲霉毒素B1含量的變化Fig.5 Change of aflatoxin B1content during different periods of bean paste

由圖5可知,在實驗室擬制作的豆瓣制曲階段AFB1含量較豆瓣其他加工過程的含量低,表明原料中蠶豆與面粉不是豆瓣醬中AFB1產生的主要因素；在制曲后期積累AFB1,可能是由于第二次翻曲后與空氣中雜菌接觸,導致污染并產生AFB1。在甜瓣子發酵階段,AFB1含量較制曲階段略微上升。由于甜瓣子是采用保溫密封發酵,一般不會與外界環境接觸,因此在其發酵期受雜菌污染的機率較低,AFB1的積累可能是由于制曲階段的雜菌引入所致。辣椒醅在整個發酵過程中其AFB1變化呈平穩上升趨勢,受AFB1污染的主要原因可能部分是由原料的帶入,但由于AFB1含量整體較低,結合相關文獻可知這與辣椒醅中的優勢菌群乳酸菌對AFB1具有分解作用有關[18]。在混合發酵至成品后,豆瓣醬中AFB1含量顯著上升,原因可能是由于成熟辣椒醅和甜瓣子的引入,也可能由于豆瓣醬后熟期是需要每日進行翻曬的,相較于甜瓣子與辣椒醅的密封發酵,該階段與空氣接觸的機會更多,因此就更容易被空氣中的雜菌污染。綜上所述,可以看出豆瓣醬的“翻曬露”階段導致豆瓣醬中AFB1的含量大幅增加。

3 結論

本研究基于加工傳統郫縣豆瓣的各關鍵工藝流程,包括制曲階段,甜瓣子發酵階段,辣椒醅發酵階段和豆瓣醬后熟階段,在實驗室對豆瓣醬進行擬制作,以此研究各工藝點的AFB1含量變化情況并得到關鍵控制點。結果表明,豆瓣加工過程中AFB1始終低于發酵調味品的國家最新限量標準(5 μg/kg),且含量隨著豆瓣醬的成熟總體保持上升趨勢。雖然在制曲環節時AFB1含量最低,但從甜瓣子發酵階段可以看出,制曲階段AFB1的累積效應是非常明顯的,所以應該繼續采用人工制曲,并且應該在制曲環節嚴加控制,防止AFB1從制曲階段開始累積。同時,從辣椒醅的AFB1含量變化可以看出造成辣椒醅中AFB1污染的主要原因是原料引入,所以應對原料辣椒醅的來源和其儲存環境嚴加把關,并對變質的辣椒及時清除。此外,在豆瓣醬發酵過程中,AFB1含量與其他加工環節相比呈現大幅上升趨勢,表明在“翻曬露”環節的豆瓣醬后熟期是影響AFB1產生的關鍵階段。而且由于這個階段翻曬頻繁(每日一次),導致豆瓣醬與空氣接觸更多從而使得其易被雜菌污染,所以豆瓣“翻曬露”階段的環境條件十分關鍵。雖然豆瓣醬中AFB1的總體含量低于國家限量標準,但為了使人們盡量避免受到食品中諸如黃曲霉毒素B1等真菌毒素的威脅,應著力改善相關的生產環境,特別應加強在生產環境中對空氣中雜菌的隔離,以此使得我國傳統食品的安全問題真正得到有效改善。

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