發酵核桃粕復合粉中乳酸菌保護劑的篩選

顧苑婷,徐素云,丁小娟,趙澤偉,丁筑紅

(貴州大學 釀酒與食品工程學院,貴州 貴陽 550025)

核桃粕(walnut dregs)是核桃經榨油后其主要的副產物,其蛋白質含量在40%左右[1],富含人體所需的各種氨基酸,脂肪含量低,符合老年人的飲食要求。據報道,從核桃粕中提取的生物活性肽具有調節高血壓、增強抗氧化能力、緩解疲勞等功能[2-4],因此可利用核桃粕生產高蛋白核桃粉直接飲用或作為半成品添加在面包、蛋糕等各類糕點中[5-6]。此外也可生產低脂核桃乳[7]或復合類低脂核桃乳[8]。乳酸菌保護劑是為了保護乳酸菌在加工過程中免受損害,最大限度的保持原有的各種生理生化活性的物質,現階段主要用于乳酸菌菌種的保藏,而在發酵乳制品中的開發和利用方向較少,在未來的發酵乳開發中具有良好發展前景[9]。薏米中含有的薏苡仁酯、薏苡仁多糖、薏苡仁油等成分有抗腫瘤[10]、增強免疫力[11]、鎮痛消炎[12]等作用。而薏米經焙烤后制成的粉末,添加到其他食品中,不但改善食品的品質,還提升了食品的風味。國內外研究者主要集中在對核桃蛋白飲料的加工工藝和配方設計,多為調配性飲料的研究,對發酵型核桃乳的研究較少,現在的大多數核桃乳開發制作工藝當中,原料基本上是把核桃乳和其他植物蛋白混合作為生產的基礎原料,如杏仁[13]、花生[14]、枸杞[15]等,鮮有薏米與核桃粕復配的研究。

本研究從核桃粕的開發利用的現狀出發,以發酵核桃粕復合乳為試驗原料[16],在發酵核桃粕復合乳中添加乳酸菌保護劑,開發一種富含活菌的發酵型固態方便食品。提高原料高值化利用水平以及產品營養保健特性,重點探討核桃粕乳酸菌固體飲料的加工關鍵技術,確定發酵核桃粕復合粉加工中最佳保護劑及其配比,提高產品活菌含量,以期為完善優化發酵核桃粕復合粉的工藝提供重要技術來源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃:市售,飽滿,無損壞變質核桃,經壓榨去油后得到核桃粕備用；薏米:市售,無霉爛、無變質,于120℃條件下烘烤20 min,然后超微粉碎機粉碎15 min,過300目篩得到薏米粉[17]。

谷氨酸鈉、脫脂乳粉、海藻糖、麥芽糊精、蔗糖、阿拉伯膠、甘油(均為食品級)、RB復合穩定劑:上海健鷹食品科技研究所；無水乙醚、乙醇、丙酮、異辛烷(均為分析純):天津市賦予精細化工有限公司；氯化鈉、硫代硫酸鈉、碘化鉀、氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀(均為分析純):成都金山化學試劑有限公司；硫酸、鹽酸、硼酸(均為分析純):重慶聯瑞化工有限公司；千里香酚藍、冰乙酸(均為分析純):成都科龍化工試劑廠；淀粉(食品級):徐州人和居食品廠。

嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum):貴州輕化工中心；平板計數瓊脂:北京陸橋技術股份有限公司；MRS培養基、MRS瓊脂培養基:實驗室自制。

1.2 儀器與設備

S-3400N掃描電子顯微鏡:日本HITACHI(日立)公司；RT-25氣流式超微粉碎機:長沙市常宏制藥機械設備廠；JM60立體膠體磨:溫州市鹿城區市中精益膠體磨機；GJJ-0.06/60高壓均質機:上海諾尼輕工機械有限公司；LD4-2型離心機:北京醫用離心機廠；SKD-800半微量凱式定氮儀:上海旦鼎國際貿易有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺:蘇州凈化設備有限公司；SHP-250型智能生化培養箱:上海興都儀器設備有限公司；B-290型噴霧干燥機:瑞士Buchi實驗室儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵核桃粕復合粉的加工工藝流程及操作要點

發酵核桃粕復合粉的制備[18-20]:核桃粕與水以1∶8質量比混合,進行磨漿均質滅菌后得到核桃粕汁。對嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌將進行活化復壯,當活菌數＞106CFU/mL(即為對數期)停止活化。將活化好的嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌發酵菌液以1∶1的比例混合,按3%的接種量(V/V)加入核桃粕復合汁中,于38℃條件下發酵時間6 h,得到發酵核桃粕汁。將原料按以下比例混合,即發酵核桃粕汁27%、薏米粉2.0%、蔗糖5%、RB復合穩定劑0.35%、水65.65%,得到發酵核桃粕復合乳。均質[21]:采用30 MPa的均質壓力,在75℃條件下均質2次。噴霧干燥[22-24]:噴霧干燥的條件為進口溫度160℃,出風溫度70℃,蠕動泵轉速8 r/min。

1.3.2 最佳保護劑的篩選試驗

(1)Plackett-Burman試驗[25-28]

采用Plackett-Burman試驗設計法對發酵核桃粕復合粉中乳酸菌保護劑進行篩選,在單因素預試驗基礎上,設計因素與水平見表1。進行統計分析選出效果最佳的保護劑進行最陡爬坡試驗逼近關鍵因素的最大響應區域,在此基礎上,采用Box-Benhnken試驗設計法進行配方優化,得出最佳配比。

表1 Plackett-Burman設計試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design experiments

(2)最陡爬坡試驗

通過PB試驗結果篩選出對發酵核桃粕復合乳活菌率及感官品質影響顯著的因素,依據各因素的效應值選擇適當步長,進行最陡爬坡試驗。

(3)Box-Behnken試驗

由最陡爬坡試驗結果,設計Box-Behnken試驗,其因素與水平見表2。

表2 Box-Benhnken試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Benhnken experiments

1.3.3 感官評定

邀請10名專家及工作人員對發酵核桃乳及發酵核桃粕復合乳的感官評分進行分析,并采用模糊數學評分法[29]對結果進行分析,感官評分標準見表3。

表3 發酵核桃粕復合粉感官評分標準Table 3 Sensory evaluation standards of fermented walnut dregs composite powders

根據感官評定依據表,建立模糊數學模型的因素集、評語集及權重集。其中以口感、色澤、組織狀態為因素集U={口感U1,色澤U2,組織狀態U3},以好、較好、一般、差為評語集V=｛好,較好,一般,差},而權重集R={R1,R2,R3}={0.4,0.3,0.3},即口感占0.4,色澤占0.3,組織狀態占0.3。根據感官評定結果,建立3個單因素評價矩陣,用模糊數學評價方法對其進行分析。對添加各乳酸菌保護劑得到的核桃粕乳樣液分別編號后,根據感官評價標準對發酵核桃粕乳的品質要求進行模糊綜合評判,建立評判集N=X×R,其中R為權重集,X為模糊矩陣。

1.3.4 綜合分值

取試驗的考察指標(活菌率M,感官評分N)采用加權綜合性評分法進行分析,其各因素隸屬函數如下[30]:

綜合分值為Yi=a1M1i+a2N2i,式中a1,a2權重系數,其中a1=0.7,a2=0.3。

1.3.5 乳酸活菌率的測定

保溫試驗法活菌率:取樣品乳液在75℃水浴鍋中保溫25 min后,測其保溫前后活菌總數之比；

噴霧干燥法活菌率[31]:噴霧干燥后復原的樣品乳液活菌總數與噴霧干燥前樣品乳液活菌數之比。

1.3.6 沖調液穩定性

稱取樣品20g置于250mL量筒中量取80℃水180g倒入燒杯中攪拌,靜置3 min,測量上清液高度h1和沖調液總高度h,按公式K=h1/h計算沖調穩定性K值。若K＜0.05,則表明樣品的沖調穩定性較好[32]。

1.3.7 分析檢測

蛋白質含量測定:參考GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》；脂肪含量測定:參考GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》；水分測定:參考GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》；總膳食纖維含量測定:參考GB/T 5009.88—2008《食品中膳食纖維的測定》；乳酸活菌數的測定:參照GB 4789.35—2010《食品微生物檢驗乳酸菌檢驗》；大腸菌群、致病菌檢驗:參照GB/T 4789.21—2003《食品微生物檢驗冷凍飲品、飲料檢驗》。

1.3.8 統計分析

采用PASW Statistics v18、Design expert及Excel軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman設計最佳保護劑篩選結果

選用試驗次數N=12的試驗設計,對7個因素進行考查,響應值為活菌率與感官分值的綜合分值(Y)。試驗設計結果見表4。

表4 Plackett-Burman設計試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of Plackett-Burman design experiments

表5 偏回歸系數及顯著性檢驗結果Table 5 Results of partial regression coefficients and significance tests

通過對表4數據的回歸方差分析,結果見表5。由表5可知,該模型顯著(P＜0.05),具有統計學意義；判定系數R2=0.931 5,表明93.15%的試驗數據可用此模型解釋。A、B、C、D、E具有顯著負效應,F、G具有顯著正效應；這7個保護劑對發酵核桃粕復合乳活菌率及感官分值的影響順序依次為B＞C＞D＞F＞E＞G＞A；因此試驗結果選擇脫脂乳粉、海藻糖、麥芽糖為主要影響因素,在后續試驗中應當減少脂乳粉、海藻糖、麥芽糖的添加比例。

2.2 最陡爬坡試驗結果

結合Plackett-Burman試驗結果,選取脫脂乳粉、海藻糖、麥芽糖進行最陡爬坡試驗。根據這3因素的效應大小比較,設定它們的變化方向和步長,最陡爬坡試驗見表6所示。

表6 最陡爬坡試驗設計結果Table 6 Results of the steepest ascent experiments design

由表6可知,2號試驗組綜合分值最高,即選擇脫脂乳粉添加量為2%、海藻糖添加量2%、麥芽糊精添加量3%范圍數值進一步進行響應面試驗優化。

2.3 Box-Benhnken Design分析法優化工藝

根據最陡爬坡試驗結果,設計Box-Benhnken試驗,以海藻糖(A)、脫脂乳粉(B)、麥芽糊精(C)為影響因素,綜合分值為響應值(Y),試驗設計與結果見表7,方差分析結果見表8。

表7 Box-Benhnken試驗設計及結果Table 7 Design and results of Box-Benhnken experiments

表8 回歸模型方差分析Table 8 Variance analysis of regression model

使用Design experts軟件進行多元回歸分析,經回歸擬合后,試驗因子對響應值的回歸方程表示為:

由表8可知,以感官分值為響應值時,模型P＜0.0100,表示二次方程模型極顯著。同時失擬項P=0.068 1＞0.05,失擬項差異不顯著,說明該方程對實驗擬合情況好,試驗誤差小。方程的決定系數為R2=0.999,表明99.9%的數據可用此方程解釋。變異系數(coefficient of variation,CV)反映模型的置信度,CV值越低,模型的置信度越高,本實驗的CV為0.12%,說明其置信度較高,模型方程能夠較好地反映真實的試驗值,可用此模型分析響應值的變化。3個因素對綜合分值影響的大小依次為脫脂乳粉＞海藻糖＞麥芽糊精。

2.4 響應面交互作用分析與優化

圖1 海藻糖、脫脂乳粉與麥芽糊精交互作用對綜合分值影響的響應面及等高線Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction among trehalose,dried skim milk and maltodextrin on comprehensive score

響應面交互作用分析與優化通過DesignExpert 8.0軟件對各因素之間的交互作用進行響應面分析,繪制響應面曲線見圖1。由圖1可知,海藻糖對發酵核桃粕復合粉中乳酸菌保護劑綜合分值影響最為顯著,表現為曲線較陡,海藻糖添加量為2.23%。而脫脂乳粉和麥芽糊精影響次之,表現為曲線較為平緩,其最佳添加量分別為2.5%和2.77%。

由軟件分析得到保護劑的最優配方為海藻糖2.23%、脫脂乳粉2.5%、麥芽糊精2.77%；在此最佳條件下,產品綜合分值理論上可達0.920。按最優工藝參數進行3次重復驗證試驗,結果取平均值,得到產品綜合分值為0.917,其中乳酸菌存活率為85.1%,感官評分8.1分；與預測值較為接近,表明得到的最優工藝參數準確可靠。

2.5 發酵核桃粕復合粉樣品的超微結構

未加保護劑及加保護劑的兩種發酵核桃粕復合粉樣品放大相同倍數后觀察電鏡圖像,結果如圖2所示。

圖2 未加保護劑(A)及加保護劑(B)產品的電鏡圖Fig.2 Electron microscopy figure of products without protective agent(A)and with protective agent(B)

由圖2A可知,未添加保護劑產品,復合乳漿黏稠,在噴霧干燥時水分沒有很好的蒸發掉,形成了不規則,黏連一起的大顆粒,乳酸菌容易被暴露在外界,降低了產品益生菌的活菌率依據[33]。由圖2B可知,添加保護劑樣品顆粒規整,呈球狀,顆粒表面有微孔,說明在噴霧干燥過程中,保護劑及復合乳漿中的蛋白質,在液滴干燥時,表面形成了致密的膜,隨著水分的蒸發,表面蛋白質膜的致密性和剛性程度不斷增加,顆粒形成了中空結構；由于顆粒內空體積＞50%,保護劑連同核桃乳漿將乳酸菌包裹在顆粒內部[34]。這樣保護劑起到了成膜性能好、防止產品結塊,改善產品組織結構等作用,同時使乳酸菌得到了保護。

2.6 發酵核桃粕復合粉指標的測定結果

原料半成品經噴霧干燥后的理化、微生物指標對比,結果見表9。

表9 產品指標檢測結果Table 9 Determination results of products indicators

由表9可知,添加保護劑的產品乳酸菌活菌水平得到明顯提高,產品乳酸菌活菌數是無保護劑產品的137.9倍,保護劑對提高乳酸菌在加工中的抗逆性具有重要作用；添加保護劑較不添加保護劑產品的水分含量低0.47%,總膳食纖維高1.40%,相關品質有所提升,可見,保護劑不但起到保護活菌作用,同時防止粘黏結粒,改善產品組織狀態等。3結論

通過Plackett-Burman試驗設計,從谷氨酸鈉、脫脂乳粉、海藻糖、麥芽糊精、蔗糖、阿拉伯膠和甘油7相關因子中篩選出對活菌率影響較突出的為:海藻糖、脫脂乳粉、麥芽糊精；其產品綜合分值為0.917,其中乳酸菌存活率為85.1%,感官評分8.1；采用Box-Behnken試驗設計優化后,保護劑的最優配比為海藻糖2.23%、脫脂乳粉2.5%、麥芽糊精2.77%。最終產品的各項指標為:乳酸菌活菌數9.71×108CFU/g、脂肪8.24%、膳食纖維5.43%、水分2.44%、蛋白質9.74%、大腸菌群≤3 MPN/100 mL、致病菌未檢出。

產品較目前蛋白固體飲料相比,原料利用核桃油加工副產物核桃粕、薏米營養保健功能及營養互補性,產品營養構成較好,特別富含活性乳酸菌,更利于健康保健。與傳統液態發酵乳品相比,其固態低水分形式利于長期貯運和銷售、食用方便,也可作為乳酸菌飲料的發酵劑和制備奶酪、酸奶雪糕的輔助營養原料。

[1]趙見軍,張潤光,馬玉娟,等.核桃粕中蛋白提取工藝的優化[J].食品科學,2014,35(18):40-46.

[2]XIUMING W,HAIXIA C,SHUQIN L,et al.Physico-chemical properties,antioxidant activities and antihypertensive effects of walnut protein and its hydrolysate[J].J Sci Food Agric,2015,7(9):2579-2587.

[3]盧 娣.核桃降壓肽的制備及分離純化研究[D].石河子:石河子大學,2015.

[4]康俊杰,陳樹俊,趙瑞歡,等.核桃粕組成測定及抗氧化多肽工藝優化的研究[J].農產品加工·學刊,2014(2):31-34.

[5]ROSENTHAL A,PYLE D L,NIRANJAN K.Aqueous and enzymatic processes for edible oil extraction[J].Enzyme Microb Tech,1996,19:402-420.

[6]SZETAO K W C,SATHE S K.Walnut(Juglans regial):proximate composition,protein solubility,protein amino acid composition and protein in vitrodigestibility[J].Sci Food Agric,2000,80:1393-1401.

[7]郝 劍,張衛民,楊紅軍,等.核桃粕制備微膠囊速溶核桃粉的工藝研究[J].陜西師范大學學報:自然科學版,2014,42(5):103-108.

[8]徐素云,羅 昱,姚 敏,等.苦蕎低脂低糖核桃乳飲料的工藝優化[J].食品與發酵工業,2014,40(7):246-250.

[9]白鳳翎,勵建榮.抗真菌性乳酸菌生物保護劑的研究進展[J].現代食品科技,2014,30(5):311-319.

[10]YU F,ZHANG J,ZHUO Y,et al.Research and application of adlay in medicinal field[J].Chinese Herbal Med,2017,9(2):126-133.

[11]QU D,SUN W J,LIU M J,et al.Bitargeted microemulsions based on coixseedingredientsforenhancedhepatictumordeliveryandsynergistic therapy[J].Int J Pharm,2016,503(1-2):90-101.

[12]賈青慧,陳 莉,王 珍,等.薏米及薏米糠氨基酸組成分析及營養評價[J].食品工業,2017,38(4):185-188.

[13]潘 楊,劉 軍,敬思群.核桃、杏仁蛋白發酵飲料工藝研究[J].中國釀造,2008,27(18):92-95.

[14]魏曉璐,黃 鑫,馮 悅,等.核桃乳(露)飲品中花生、大豆成分的PCR檢測方法[J].食品工業科技,2014,35(13):288-291,295.

[15]牛美蘭,邢建華,張 強,等.枸杞核桃乳工藝條件與配方[J].湖北農業科學,2012,51(12):2549-2551,2559.

[16]劉瑞芳.核桃蛋白發酵乳的生產工藝研究[D].太原:山西大學,2015.

[17]回瑞華,侯冬巖,郭 華,等.薏米中營養成分的分析[J].食品科學,2005,26(8):375-377.

[18]敬思群,李桂榮,陳曉平.乳酸菌發酵核桃乳工藝及物性學研究[J].中國乳業,2005(4):52-56.

[19]李成濤,呂嘉柄.乳酸菌及其發酵乳制品的發展趨勢[J].中國釀造,2005,24(8):12-15.

[20]LINGDREN S E,DOBROGOSZ W J.Antagonistic activities of lactic acid bacteria in food and feed fermentations[J].FEMS Microbiol Rev,1990,87(1-2):149-163.

[21]閻 靳,劉 偉.提高全脂核桃乳穩定性的生產工藝研究[J].中國奶牛,2014(14):37-40.

[22]孫顏君,呂加平,劉振民.不同噴霧干燥溫度對乳蛋白濃縮物加工性質的影響[J].食品科技,2014,39(1):42-47.

[23]KEOGH M K,MURRAY C A,KENNEDY B T O.Effects of ultrafiltration of whole milk on some properties of spray-dried milk powders[J].Int Dairy J,2013,13(12):995-1002.

[24]AGUILAR C A,HOLLENDER R,ZIEGLER G R.Sensory characteristics of milk chocolate with lactose from spray-dried milk powder[J].J Food Sci,2015,59(6):1239-1243.

[25]MONTOM E D C.Design and analysis of experiments[M].New York:John Wiley&Sons,1991:35-40.

[26]ROBINSON T J,LARAMIE W Y.The design and analysis of industrial experiments[M].London:Longman Group Limited,1978:45-48.

[27]史亞軍,王 媚,吳 星,等.Plackett-Burman設計與星點設計-效應面法優化珠子參皂苷磷脂復合物制備工藝[J].中國藥房,2015(4):518-521.

[28]楊冀艷,胡 磊,許 楊,等.Plackett-Burman設計和響應面法優化荷葉總黃酮的提取工藝[J].食品科學,2009,30(6):29-33.

[29]KAACK K,CHRISTENSEN LP,HUGHES M,et al.The relationship between sensory quality and volatile compounds in raw juice processed from elderberries[J].Eur Food Res Technol,2005,221(3-4):244-254.

[30]李 鵬.多指標綜合評價的回歸評分法[C]//中國航空學會.2015年第二屆中國航空科學技術大會論文集,中國航空學會:2015.

[31]周 曼,柳 永,毛爭爭,等.高活菌率的干酪乳桿菌微膠囊研究[J].浙江農業學報,2014,26(2):461-466.

[32]馮 穎,何 群.噴霧干燥法生產無梗五加果粉工藝[J].江蘇農業科學,2016,44(11):329-333.

[33]付 博,馬 齊,王衛衛.乳酸雙歧桿菌噴霧干燥工藝研究[J].中國乳品工業,2010(5):10-13.

[34]張 煜,孫 波,接偉光.活性乳酸菌豆粉噴霧干燥工藝的優化[J].食品工業科技,2012,33(10):261-267.