低氮對釀酒酵母發酵過程中酯類物質合成的影響

董書甲,秦偉帥,劉燦珍,楊 雪,趙新節*

(1.齊魯工業大學(山東科學院)山東省微生物工程重點實驗室,山東 濟南 250353；2.泰山學院 生物與釀酒工程學院,山東 泰安 271021)

在酒精發酵過程中酵母合成葡萄酒中的大部分揮發性物質,這些揮發性物質主要包括醇類、酯類和酸類化合物[1-2]。葡萄酒中酯類物質的含量很少,通常總量＜100mg/L,但酯類物質即使濃度較低也很容易被察覺到。酯類物質的成分、含量和比例等發生微小的變化時,都會對葡萄酒的風味產生巨大的影響,因此酯類對葡萄酒的香氣具有重要影響[3]。葡萄酒中的酯類物質主要包括乙酸酯和乙基酯,其中乙酸乙酯是葡萄酒中含量較高的乙酸酯,其賦予葡萄酒水果香味,另外含量較高的乙酸酯還有乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯,這兩種乙酸酯分別賦予葡萄酒香蕉味和玫瑰花香味,形成乙酸酯的酸為乙酸,醇包括乙醇和氨基酸與糖代謝產生的高級醇[4]。葡萄酒中的乙基酯主要有辛酸乙酯、己酸乙酯和癸酸乙酯,它們往往賦予葡萄酒草莓和青蘋果的香味[5-7],形成乙基酯的酸來源于碳、氮的生物代謝或者脂肪酸的生物合成[4],醇是乙醇。

氮素是發酵液中重要的組成成分,酵母菌的可同化氮(yeastassimilable nitrogen,YAN)為除脯氨酸外的游離α-氨基氮化合物、銨態氮和小分子多肽[9]。目前較多的研究表明,釀酒酵母進行正常的生長代謝所需要的較合適的氮濃度為380 mg N/L[9-10],低氮處理會改變酵母體內的氮代謝及糖代謝途徑,酵母體內許多代謝產物的生成都要有氮代謝及糖代謝途徑的參與,其中低氮條件下高級醇的生成量會增加,酯類物質的合成也需要糖代謝及氮代謝下游產物的參與[2]。目前關于酯類物質的研究多只關注發酵結束時酯類物質的最終含量及其影響因素,而關于發酵過程中各種酯類物質的生成規律及低氮對酯類合成的研究較少。本研究以模擬葡萄汁為試驗材料,采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜法分析了不同低氮條件下模擬葡萄汁酒精發酵過程中酯類物質的生成規律,并探討了低氮對酯類物質生成規律及含量的影響,為了解葡萄酒發酵過程中葡萄酒香氣的變化及調整氮源含量以提高葡萄酒中酯類物質的含量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 酵母菌株

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)EC1118:上海杰兔工貿有限公司。該釀酒酵母廣泛應用于葡萄酒的生產,綜合發酵能力強,具有較高的果糖發酵能力,通常能使葡萄酒發酵至干,也能成功進行二次發酵接種。

1.1.2 化學試劑

葡萄糖、果糖、酒石酸、DL-蘋果酸、鹽酸硫胺素、吡哆醇鹽酸鹽、L-脯氨酸、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、NaCl、MnSO4·H2O、ZnSO4、CuSO4·5H2O、KI、CoCl2·6H2O、H3BO3、NaMoO4·2H2O、NH4Cl:國藥集團化學試劑有限公司；肌醇、煙酸、泛酸鈣、生物素、麥角甾醇(95%)、油酸鈉:上海源葉生物科技有限公司；煙酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-色氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-天門冬氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-甲硫氨酸、L-酪氨酸、L-甘氨酸、L-賴氨酸、L-半胱氨酸、Tween 80:北京索萊寶科技有限公司；L-纈氨酸,L-亮氨酸、L-異亮氨酸:上海阿拉丁生化科技股份有限公司；KH2PO4、KCL、KOH:天津市大茂化學試劑廠；4-甲基-2-戊醇(純度98%):美國Aldrich公司。

1.1.3 模擬葡萄汁

本試驗所用的發酵介質為模擬葡萄汁,其配方參見文獻[9,11],并用緩沖液調節其pH至3.3。

葡萄汁中碳源含量:120 g/L葡萄糖、120 g/L果糖、6 g/L酒石酸、6 g/LDL-蘋果酸。

模擬葡萄汁中礦物鹽含量:750mg/LKH2PO4、272mg/L KCl、250mg/LMgSO4·7H2O、155mg/LCaCl2·2H2O、200 mg/L NaCl、4mg/LMnSO4·H2O、4 mg/LZnSO4、1 mgCuSO4·5H2O、0.4 mg CoCl2·6H2O、1 mg/L H3BO3,1 mg/L NaMoO4·2H2O、1mgKI。

模擬葡萄汁中生長素含量:20 mg/L肌醇、2 mg/L煙酸、1.5 mg/L泛酸鈣、0.25 mg/L鹽酸硫胺素、0.25 mg/L吡哆醇鹽酸鹽、0.003 mg/L生物素。

氮源中各組分比例為:18.6%NH4Cl、20.5%L-脯氨酸、16.9%L-谷氨酰胺、12.5%L-精氨酸、6%L-色氨酸、4.9%L-丙氨酸、4%L-谷氨酸、2.6%L-絲氨酸、2.6%L-蘇氨酸、1.6%L-亮氨酸、1.5%L-天門冬氨酸、1.5%L-纈氨酸、1.3%L-苯丙氨酸、1.1%L-異亮氨酸、1.1%L-組氨酸、1.1%L-甲硫氨酸、0.6%L-酪氨酸、0.6%L-甘氨酸、0.6%L-賴氨酸、0.4%L-半胱氨酸。

厭氧因子組分:15 mg/L麥角甾醇、5 mg/L油酸鈉、0.5 mL/L Tween 80。

1.2 儀器與設備

自動固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)進樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、7890B氣相色譜-5977A型質譜聯用儀:美國Supelco公司；DB-WAX毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm):美國J&W公司；SW-CJ-2D型雙人無菌工作臺:蘇州凈化設備有限公司；UV-1600PC型紫外分光光度計:上海美譜達儀器有限公司；PHS-3D型pH計:上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗設計

將配制好的180 mgN/L、280 mgN/L、380 mgN/L三種氮源質量濃度的模擬葡萄汁110℃滅菌30 min。將釀酒酵母EC1118在37℃溫水中活化30 min,分別以106CFU/mL接種于氮源質量濃度分別為180mgN/L、280mgN/L、380mgN/L的模擬葡萄汁中,發酵溫度控制在25℃,以380 mgN/L作為對照組。每個實驗設計3個重復。

1.3.2 發酵液理化指標的測定

發酵液理化指標檢測嚴格按照國家標準GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法進行檢測。主要包括殘糖、酒精度、總酸、揮發酸、pH值等指標。

1.3.3 酵母菌生長曲線測定

本試驗中測定的OD600nm值是酵母菌體在波長600 nm處的吸光度值,以此反映模擬葡萄汁中酵母菌體的數量[12]。發酵啟動后,每隔12 h測定一次發酵液的OD600nm值,每組處理做3次重復取平均值。

1.3.4 酯類物質的分析

酯類物質的提取:參照BARBOSA C等[13]的方法進行。在20 mL頂空瓶中,加入8 mL發酵液,2 g NaCl和20 μL的2.00 g/L內標物(4-甲基-2-戊醇),以及轉子。放置于45℃的可加熱磁力攪拌器上,預熱10 min后進行萃取,萃取50 min后進樣,解吸10 min。

氣相色譜條件:色譜柱為VF-WAXms(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；升溫程序:40℃下保持2 min,然后以6℃/min的速度升到230℃,保持15 min；載氣為氦氣,平均線速度為25 cm/s,不分流進樣。

質譜條件:電子電離(electron ionization,EI)源；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；檢測器溫度250℃；質量掃描范圍30～400 m/z。

定性分析:用計算機譜庫美國國家標準技術研究所(national institute of standards and technology,NIST)14.L進行人工解析定性。

定量分析:采用內標法進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 不同氮源濃度下釀酒酵母的生長曲線

3種氮源濃度下釀酒酵母的生長曲線如圖1所示。整體而言,釀酒酵母的生長速率隨著氮源濃度的增加而加快。由圖1可以看出,3種氮源濃度下達到穩定期的時間和穩定期酵母菌體的濃度存在一定差異。氮源質量濃度為280 mg/L(YAN280)和氮源質量濃度為380 mg/L(YAN380)條件下酵母同時在第4天達到穩定期,且穩定期酵母菌體的濃度相差不大；氮源質量濃度為180 mg/L(YAN180)條件下酵母在第5天達到穩定,且菌體濃度明顯低于YAN280和YAN380下菌體的濃度,這與孫悅[14]的研究結果相似。這說明低氮脅迫抑制了酵母菌的繁殖速率,并降低了其穩定期的菌體濃度。

圖1 不同氮源濃度對發酵過程中酵母生長量的影響Fig.1 Effects of different nitrogen concentrations on yeast biomass during fermentation

2.2 不同氮源濃度對發酵液理化指標的影響

3種氮源濃度的模擬葡萄汁分別在25℃條件下發酵,發酵結束后對各組發酵液的基本指標(殘糖、酒精度、總酸、揮發酸和pH)進行分析檢測,結果見表1。由表1可知,三組發酵液中的殘糖含量均＜4 g/L,其中氮源質量濃度為280 mgN/L的模擬葡萄汁發酵結束后具有較低的殘糖含量(3.57 g/L),且其酒精含量為最高(12.41%vol)；氮源質量濃度為380 mgN/L的模擬葡萄汁發酵結束后其殘糖含量為最高(3.85 g/L),其酒精含量最低(2.41%vol)。氮源濃度為180 mgN/L的發酵液具有較低總酸(9.01 g/L)及揮發酸(0.49 g/L)含量；3種氮源濃度下發酵液pH相差不大。

表1 不同氮源濃度對發酵液理化指標的影響Table 1 Effects of different nitrogen concentrations on physicochemical indexes of fermentation must

2.3 不同氮源濃度下酯類物質的生成規律

利用自動固相微萃取-氣相色譜-質譜法對3種氮源濃度的發酵液進行酯類物質的定性定量分析,三種氮源濃度下酵母合成的酯類物質的種類沒有差別,共有7種,包括3種乙酸酯(乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯)和4種乙基酯(丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯)。發酵結束后發酵液中酯類物質的總量,結果見圖2。

圖2 不同氮源濃度發酵液中酯類的總量Fig.2 Total esters content in fermentation must with different nitrogen concentrations

由圖2可以看出,酯類物質的總量隨著氮源濃度的降低而減少,說明低氮處理會降低發酵液中酯類物質的含量,這可能是低氮處理抑制了中鏈脂肪酸的生成,也就降低了相應脂肪酸乙酯的含量[8]。同時低氮處理也會抑制醇乙酰基轉移酶的合成,從而降低了乙酸酯的生成量[15]。不同氮源濃度發酵液中乙酸酯與乙基酯的含量,結果見圖3。

圖3 不同氮源濃度發酵液中乙酸酯與乙基酯的含量Fig.3 Contents of acetate and ethyl ester in fermentation must with different nitrogen concentrations

由圖3可以看出,3種氮源濃度下釀酒酵母生成的乙酸酯含量(55.77～64.08mg/L)明顯高于乙基酯的含量(6.63～8.33 mg/L),這與參與發酵的菌株有關,釀酒酵母通常生成較高含量的乙酸酯,而非釀酒酵母生成乙基酯含量較高[1,16]。另外釀酒酵母合成的各種酯類物質需要穿過細胞膜才能釋放到葡萄酒中,其中乙酸酯穿越細胞膜的速率較快,但乙基酯的跨越細胞膜的速度與脂肪酸碳鏈的長度有關,脂肪酸碳鏈的越長其轉移速率越低,研究表明己酸乙酯可以全部轉移到細胞外,而癸酸乙酯只有8%～17%的釋放量[17]。

醇乙酰基轉移酶途徑和酯酶途徑是乙酸酯合成的兩條主要途徑[18]。乙酸酯的酯酶途徑是一個可逆反應,乙酸酯的合成與分解都可以由酯酶催化[19]。發酵過程中乙酸乙酯、乙酸異戊酯及乙酸苯乙酯的動態變化結果見圖4。

圖4 發酵過程中乙酸乙酯(A),乙酸異戊酯(B)及乙酸苯乙酯(C)的動態變化Fig.4 Dynamic changes of ethyl acetate(A),isoamyl acetate(B)and phenethyl acetate(C)during the fermentation

由圖4A可知,乙酸乙酯在發酵過程中的生成趨勢在3種氮源濃度下是相似的,其含量在發酵過程中逐漸增加,其中發酵前期(發酵前4 d)乙酸乙酯的生成速率較快,平均每天增加9.03～10.40 mg/L,隨著發酵的進行其含量逐漸穩定,氮源質量濃度為180 mg/L的發酵液中乙酸乙酯的含量在發酵12d后逐漸穩定在54mg/L,氮源質量濃度為280mg/L和380 mg/L的發酵液中乙酸乙酯的含量在發酵14 d后分別穩定在54mg/L和62mg/L。由圖4B可知,氮源質量濃度為280 mg/L和380 mg/L的發酵液中乙酸異戊酯的含量分別在第6天和第8天達到最大值后又逐漸降低,3種氮源濃度的發酵液在第12d達到最低值后又迅速增加。由圖4C可知,隨著發酵的進行氮源質量濃度為180 mg/L的發酵液中乙酸苯乙酯的含量在第4天達到一個峰值(1.02 mg/L),氮源質量濃度為280 mg/L和380 mg/L的發酵液中乙酸苯乙酯的含量在第6天達到峰值(0.83 mg/L、0.80 mg/L),隨后其含量緩慢降低。在發酵過程中酵母會合成各種酯類,同時由于發酵液的pH和酯酶的存在也會導致酯類的水解[2,8],在各個發酵階段酯類的含量都是水解與合成平衡的結果。研究表明酯酶的水解作用要遠大于合成作用,對于不同的乙酸酯其水解效果也不同,在發酵中后期乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯含量的波動的較大,而乙酸乙酯的含量相對穩定,這可能是由于酯酶對乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯的水解能力大于其對乙酸乙酯的水解能力[20]。發酵結束時YAN180的發酵液中乙酸乙酯和乙酸異戊酯的含量明顯低于YAN280和YAN380的發酵液中乙酸乙酯和乙酸異戊酯的含量,而YAN180的發酵液中乙酸苯乙酯的含量明顯高于YAN280和YAN380的發酵液中乙酸苯乙酯的含量,這可能是由于低氮脅迫改變了糖代謝途徑中α-酮酸的代謝路徑,從而導致相應高級醇含量的變化,進而影響了相應的乙酸酯的含量[8]。

在酵母體內,乙醇酰基轉移酶和乙醇己酰轉移酶催化脂肪酸和乙醇生成乙基酯[21]。在發酵過程中丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯及癸酸乙酯含量變化,結果見圖5。由圖5A可知,3種氮源濃度的發酵液中丁酸乙酯的含量在第8天達到最大值后逐漸降低。乙醇酰基轉移酶和乙醇己酰轉移酶同時具有合成與水解作用[8],在發酵前期這兩種酶可能對丁酸乙酯主要起到合成作用,當丁酸乙酯的含量達到最大時,這兩種轉移酶主要通過其水解作用調節丁酸乙酯在葡萄酒中含量的平衡。由圖5B、圖5C可知,己酸乙酯和辛酸乙酯的含量隨著發酵的進行逐漸增加,其中己酸乙酯在發酵前期(發酵前10 d)其含量增加緩慢,在發酵后期迅速增加,而在發酵前期(發酵前6 d)辛酸乙酯的生成速率(平均每天增加0.54～0.6 mg/L)明顯高于其在發酵后期(發酵6～16 d)的生成速率(平均每天增加0.11～0.15 mg/L)。由圖5D可知,其含量隨著發酵的進行逐漸增加,3種氮源濃度的模擬葡萄汁中癸酸乙酯的含量在發酵6～10 d達到相對穩定的含量(0.12～0.14 mg/L),YAN180和YAN280的發酵液中癸酸乙酯的含量在發酵后期又出現了一個緩慢增加的趨勢,其發酵結束時的含量分別達到了0.23 mg/L、0.17 mg/L。發酵結束時丁酸乙酯的含量隨著氮源濃度的降低而降低,由0.20 mg/L降低至0.11 mg/L；YAN180的發酵液中己酸乙酯的含量(2.19 mg/L)明顯低于YAN280和YAN380的發酵液中己酸乙酯的含量(3.05mg/L)；癸酸乙酯的含量隨著氮源濃度的降低逐漸增加,其含量由0.13 mg/L增加至0.23 mg/L,這可能是由于低氮處理改變了相應脂肪酸的代謝[8,22]。

圖5 發酵過程中丁酸乙酯(A)、己酸乙酯(B)、辛酸乙酯(C)及癸酸乙酯(D)的動態變化Fig.5 Dynamic changes of ethyl butyrate(A),ethyl hexanoate(B),ethyl octanoate(C)and ethyl caprate(D)during fermentation

3 結論

本試驗研究結果表明,低氮脅迫抑制了酵母菌的繁殖速率,并降低了其穩定期的菌體濃度。三種氮源濃度下酵母合成的酯類物質的種類沒有差別,共有7種,包括3種乙酸酯和4種乙基酯。低氮脅迫下酯類物質的總量降低,氮源質量濃度為380mg/L的發酵液中酯類物質的總量為71.9mg/L,氮源質量濃度為180 mg/L的發酵液中酯類物質的總量為62.4 mg/L。3種氮源濃度下釀酒酵母生成的乙酸酯含量(55.77～64.08mg/L)明顯高于乙基酯的含量(6.63～8.33mg/L)。總體來說,低氮并沒有改變這7種酯類物質的生成規律,但影響了發酵結束時酯類物質的含量。乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的含量在發酵過程中逐漸增加。隨著發酵的進行3種氮源濃度的發酵液中丁酸乙酯的含量在發酵第8天達到最大值后逐漸降低。乙酸苯乙酯的含量在發酵前期(發酵4～6 d)迅速達到一個峰值,隨后其含量緩慢降低。隨著發酵的進行乙酸異戊酯的含量先增加后降低,在發酵12 d時達到最低值后又迅速增加。低氮脅迫下增加了乙酸苯乙酯和癸酸乙酯的生成量,降低了乙酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯和己酸乙酯的含量。因此,當可同化氮含量為380 mg/L時,將會促進酯類物質的生成,在葡萄酒的生產過程中可適當提高可同化氮含量來提升葡萄酒花果香氣,盡量避免低氮脅迫；發酵過程中各種酯類化合物含量的動態變化為理解葡萄酒發酵過程中的香氣變化提供了理論支撐。

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