響應面法優化紅豆納豆的發酵工藝

王 琳,高辰哲,劉丹怡,劉 琳,李明洋,李海龍,韓建春,2*

(1.東北農業大學 食品學院,黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省綠色食品科學研究院,黑龍江 哈爾濱 150000)

紅豆是一種藥食同源的食物,味甘、無毒,在日常生活中較為常見[1-2],其具有豐富的營養物質和顯著的抗氧化作用,種皮中含有多酚、單寧、皂苷等多種生物活性物質[3-4],以紅豆為原料制作的食品深受大眾喜愛。在飲料行業中,紅豆可做成多種飲料[5-8],如紅豆乳飲料[9]、紅豆纖維飲料[10]等。紅豆發酵食品也廣受喜愛,如紅豆果醋[11]、紅豆果酒[12]、紅豆米酒[13]等。

納豆是一種大豆發酵食品,含有卵磷脂、維生素E、多胺等成分[14]。現有研究表明,納豆具有降血壓、溶血栓、抗菌、抗腫瘤、預防骨質疏松等功能[15]。雖然納豆是一種成本低廉、營養豐富的功能性食品,但因其具有的特殊氨臭味不易被廣大消費者接受[16-17]。而紅豆具有較高的水分、粘多糖及總氨基酸含量,可以作為納豆制作原料[18]。

接種量、接種種齡對納豆芽孢桿菌(Bacillus subtilis natto)的生長狀態具有重要影響[19]。本研究以紅豆為原料,選取優選高產納豆菌株,采用單因素法探索接種量、接種種齡及發酵時間對紅豆納豆品質的影響,并采用響應面法優化了紅豆納豆發酵工藝,旨在創新紅豆納豆發酵工藝,開發新型納豆產品,以期為紅豆相關產品的開發提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅豆:黑龍江齊齊哈爾綠谷米業；納豆芽孢桿菌(Bacillus subtilisnatto)1.1086:中國食品發酵工業研究所；纖維蛋白原(凝固物含量為59%)、尿激酶標準品(1 240 IU/支):中國藥品生物制品檢定所；葡萄糖(分析純):中國浙江玉環紅星生化制品廠。

固體斜面培養基:蛋白胨1%,牛肉膏0.5%,氯化鈉0.5%,瓊脂1.5%,葡萄糖1%,pH 7.2～7.4,121℃滅菌20 min。

液體培養基:蛋白胨1%,牛肉膏0.5%,氯化鈉0.5%,葡萄糖1%,pH 7.2～7.4,121℃滅菌20 min。

二級培養基:蛋白胨1%,牛肉膏0.5%,氯化鈉0.5%,葡萄糖1%,pH 7.2～7.4,121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

BL610電子天平:上海靜天電子儀器有限公司；DK-98-I電子恒溫水浴鍋:江蘇省金壇市江南儀器廠；TGL-16C臺式離心機:上海安亭科學儀器廠制造；303A型電熱恒溫培養箱:瀘南電爐烘箱廠；LDZX-50KB立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋:上海申安醫療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 紅豆納豆制作工藝流程及操作要點

操作要點:將納豆芽孢桿菌接種到固體斜面培養基上,37℃培養12 h使其活化后,用接菌環挑兩環納豆芽孢桿菌接種到裝有液體培養基的試管中37℃培養8 h,之后接種到二級培養基,200 r/min的搖床18℃恒溫培養24 h,備用。

選取顆粒飽滿的優質市售紅豆作為原料,清水沖洗2～3遍去除雜質,用3倍質量的清水浸泡,以吸水后質量增加2倍為宜。在相同規格的紗布袋中裝入洗凈后瀝干水的濕豆子,每個袋子裝500 g,121℃滅菌30 min,重復滅菌兩次,第二次滅菌時,將首尾兩端袋子對調,保證充分滅菌及蒸煮。于無菌操作臺中冷卻至45℃后,將一定量菌液接入到處理過的紅豆中,攪拌均勻,使菌液充分與紅豆接觸,于37℃恒溫培養箱培養一定時間。將發酵好的成品放入4℃的冰箱中,后熟24 h,得成品。

1.3.2 紅豆納豆發酵條件的單因素試驗

選擇接種量、接種種齡、發酵時間進行單因素試驗,考察接種量(2%、4%、6%、8%、10%)、接種種齡(9 h、12 h、15 h、18 h、21 h)、發酵時間(16 h、17 h、18 h、19 h、20 h、21 h、22 h、23 h、24 h)對紅豆納豆中納豆激酶酶活力和紅豆納豆感官品質的影響。

1.3.3 響應面法優化紅豆納豆發酵條件

根據單因素試驗結果,選取接種量(A)、接種種齡(B)和發酵時間(C)3個因素為自變量,以感官評分(R)為響應值,設置3因素3水平進行響應面優化試驗對紅豆納豆發酵條件進行優化,響應面試驗因素與水平如表1所示。

表1 紅豆納豆發酵條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation conditions optimization of red bean natto

1.3.4 檢測方法

納豆激酶酶活力的測定[20-21]:取適量尿激酶標準品,用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)將尿激酶標準品配制成濃度為100 IU/mL、150 IU/mL、200 IU/mL、250 IU/mL、300 IU/mL標準溶液,用微量進樣器注入平板孔內,測定溶圈直徑,計算溶圈面積,以尿激酶酶活力(x)為橫坐標,溶圈面積(y)為縱坐標,繪制尿激酶標準曲線。稱取新鮮紅豆納豆1 g加入20 mL無菌去離子水中,充分振蕩后進行過濾,取10 μL點樣于纖維蛋白平板,10 min后37℃保溫18 h,測定溶圈直徑,計算溶圈面積,由尿激酶標準曲線計算出被測樣品中納豆激酶酶活力。

1.3.5 感官評價

在本學院選擇20名學生(10男10女)組成感官評價小組,采用雙盲法從顏色、香氣、滋味、組織形態4個方面進行打分。隨機對樣品進行數字編碼,排列樣品順序,滿分100分,感官評分標準見表2。

表2 紅豆納豆感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of red bean natto

2 結果與分析

2.1 尿激酶標準曲線的繪制

以尿激酶酶活力(x)為橫坐標,溶圈面積(y)為縱坐標,繪制尿激酶標準曲線,結果見圖1。

圖1 尿激酶標準曲線Fig.1 Standard curve of urokinase

由圖1可知,尿激酶標準曲線的線性回歸方程為y=0.005 2x+0.879 6,相關系數R2=0.999 1,表明尿激酶酶活與溶圈面積線性關系良好。

2.2 單因素試驗

2.2.1 接種量對紅豆納豆發酵的影響研究

考察接種量對紅豆納豆中納豆激酶酶活與感官品質的影響,結果如圖2所示。

圖2 接種量對納豆激酶酶活力與感官品質的影響Fig.2 Effect of inoculum on nattokinase activity and sensory quality

由圖2可知,隨著接種量的增加,納豆激酶酶活力和感官評分均呈現先增加后下降的趨勢。當接種量為6%時,產品中納豆激酶酶活力達到最大值,為1 148 U/g,感官評分為93分；當接種量為8%時,酶活力為1 112 U/g,感官評分為94分。接種量在2%～8%范圍內,感官綜合評分呈上升趨勢；當接種量＞8%,感官評分開始下降。這可能因為當接種量過小時,菌體則無法在發酵液內充分生長,接種量達到6%時,發酵液中營養成分被充分利用,納豆激酶活力達到最大；當接種量＞6%時,紅豆基質中的營養物質不足以維持芽孢桿菌快速增殖,從而抑制了相對酶活力[22-23]。此階段感官評分呈現上升趨勢,說明增加納豆激酶接種量有助于紅豆納豆品質的提升,接種量＞8%時感官評分開始下降,可能是因為過多的納豆激酶阻礙了體系的氧氣傳遞和菌體獲得營養物質,影響了紅豆納豆的品質。綜合比較,選擇接種量6%作為最適接種量。

2.2.2 接種種齡對納豆激酶酶活的影響

考察接種量對紅豆納豆中納豆激酶酶活與感官品質的影響,結果如圖3所示。

圖3 接種種齡對納豆激酶酶活力與感官品質的影響Fig.3 Effect of inoculation age on nattokinase activity and sensory quality

納豆芽孢桿菌培養10～15 h處于對數生長期,菌體生長旺盛,有利于縮短微生物生長動力曲線中延遲期的時間。由圖3可知,隨著接種菌齡的增長,納豆激酶酶活力整體呈先增加后下降的趨勢,而感官評分先增加后趨于平穩,當接種種齡為15 h時,納豆激酶酶活力達到最高值,為1 147 U/g；當接種種齡為18 h時,感官評分達到最高,為94分。這可能是因為接入發酵液內的菌種處于對數生長期,即菌體處于旺盛生長階段,短時間內會生成大量的納豆激酶,具備較高的酶活力。當接種種齡為18 h時,菌體結束對數增長期,此時菌體的細胞含量最高,納豆激酶酶活力開始下降,但發酵速度依然較高,感官品質最佳。綜合比較,因此選取接種種齡為18 h的納豆芽孢桿菌作為發酵菌株。

2.2.3 發酵時間對紅豆納豆發酵的影響

考察接種量對紅豆納豆中納豆激酶酶活與感官品質的影響,結果如圖4所示。

圖4 發酵時間對納豆激酶酶活力與感官品質的影響Fig.4 Effect of fermentation time on nattokinase activity and sensory quality

由圖4可知,隨著發酵時間的延長,納豆激酶酶活力和感官評分整體均呈先增加后下降的趨勢,當發酵時間為22h時,產品紅豆納豆的納豆激酶酶活力和感官評分均達到最大值,分別為1 058 U/g和94分。原因可能是在較短的發酵時間內,微生物不能完全利用紅豆的營養物質進行增殖生長,而過長的發酵時間會造成紅豆基質中剩余的營養物質不足以維持納豆芽孢桿菌快速增殖及大量納豆激酶合成,從而導致納豆激酶酶活力降低。因此,確定最適發酵時間為22 h。

2.3 響應面法優化紅豆納豆發酵工藝

單因素試驗結果表明接種量、接種種齡與發酵時間均對納豆激酶酶活力及紅豆納豆感官評分具有影響作用,與現有研究結果一致[24-25]。在單因素試驗結果的基礎上,選取接種量(A)、接種種齡(B)和發酵時間(C)為影響因素,以感官評分(R)為響應值,根據響應曲面法試驗設計原理,設計3因素3水平的二次回歸方程來擬合因素和指標(響應值)之間的函數關系,確定最優發酵工藝參數,響應面試驗設計及結果見表2,方差分析結果見表3。

表2 紅豆納豆發酵條件優化響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiments for fermentation conditions optimization of red bean natto

利用Design Expert 8.0.6軟件對表2試驗數據進行多元回歸擬合,獲得二次多項回歸模型方程為:

表3 響應面試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experiments results

由表3可知,方程因變量與自變量之間的線性關系明顯,該模型極顯著(P＜0.01),失擬項不顯著(P＞0.05),并且該模型R2=98.99%,R2adj=97.70%,說明該模型與試驗擬合良好,自變量與響應值之間線性關系顯著,可以用于該反應的理論推測。由F值大小可以推斷影響紅豆納豆感官品質的各因素主次順序為:C＞A＞B,即發酵時間＞接種量＞接種種齡。一次項A和交互項AB、BC對紅豆納豆感官評分的影響顯著(P＜0.05)；一次項C、交互項AC和二次項A2、C2對紅豆納豆感官評分的影響極顯著(P＜0.01)。其他因素對紅豆納豆感官評分的影響不顯著(P＞0.05)。

利用Design Expert 8.0.6軟件,作出各因素對紅豆納豆感官評分的響應面分析圖,考察所擬合的響應曲面的形狀,分析接種量、接種種齡、發酵時間對紅豆納豆感官評分的影響,結果見圖5。

圖5 接種量、接種種齡和發酵時間的交互作用對紅豆納豆感官評分影響的響應面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interactions between inoculum,inoculation age and fermentation time on sensory evaluation of red bean natto

由圖5可知,接種量與發酵時間、接種量與接種種齡、接種種齡與發酵時間之間均有一定的交互作用,最佳預測點在試驗考察范圍內。因此,該二階模型具有良好的擬合度,能真實地描述各因素與響應值之間的關系。接種量、接種種齡、發酵時間與紅豆納豆感官評分有顯著的相關性,表現為曲面較陡,其中發酵時間對紅豆納豆感官評分影響最大。結合等高線的疏密程度可知,接種量與接種時間的交互作用影響更顯著,接種量與接種種齡、接種種齡與發酵時間兩兩之間有一定的交互作用,但交互作用的影響不如接種量與接種時間的交互作用影響顯著。

為獲取最大感官綜合值,采用聯合求解法確定最佳發酵工藝條件為:接種量6.03%、接種種齡18.00 h、發酵時間21.58 h。為符合實際生產需求,將最佳發酵工藝條件修正為接種量6%、接種種齡18 h、發酵時間21.5 h,在此發酵工藝條件下,理論預測感官評分為97分。

為驗證試驗結果的可信度,采用同樣工藝條件進行3次紅豆納豆的平行發酵試驗,得到紅豆納豆感官評分的平均值為97.7分,與理論預測值差異不明顯,測定納豆激酶酶活力平均值為1 140 U/g。表明該模型準確可靠,利用該模型在紅豆納豆生產實踐中進行預測是可行的。

3 結論

本實驗采用單因素試驗和中心組合設計試驗,利用響應面分析法優化紅豆納豆發酵工藝條件,最終得到優化發酵工藝條件為:接種量6%、接種種齡18 h、發酵時間21.5 h,在此工藝條件下,發酵得到的紅豆納豆具有納豆的香味,滋味獨特,色澤誘人,黏液量豐富,感官評分為97.7分,納豆激酶酶活力為1140U/g,與響應面法預測值差異不明顯,驗證了試驗模型的可行性,為紅豆產品開發及紅豆納豆的產業化生產提供參考。

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