甘藍型油菜蕾薹期抗旱相關性狀的QTL分析

黃 倩，趙永國，黃祥偉，朱宗河，劉云清，馬海清，程 勇，鄒錫玲，徐勁松，張學昆，陸光遠

(1.農業部油料作物生物學與遺傳育種重點實驗室/中國農業科學院油料作物研究所， 湖北 武漢 430062；2.安徽農業大學農學院， 安徽 合肥 230036；3.湖北省浠水縣農業局，湖北，浠水，438200)

作物在生長過程中經常遭受到各種生物脅迫和非生物脅迫，其中干旱脅迫是非生物脅迫中對作物生長和產量影響最嚴重的脅迫之一[1]。油菜是重要的油料作物,我國每年油菜種植面積和總產出約占世界的1/3[2]。干旱直接影響油菜的生長，導致油菜總莢數、每莢粒數、單株種子數及單株產量顯著下降[3-4]，嚴重影響油菜產量。長江流域是我國油菜主產區，雖然降雨充沛，但全年降水分布不均勻，季節性干旱頻發[5]，比如2010年發生的西南五省冬、春季特大干旱，2011年長江中游五省的春、夏季特大干旱。有研究發現春旱使中國長江中下游地區的油菜平均減產20%以上[6]。而春旱正值油菜蕾薹期，是生長需水量較大時期，此時發生干旱嚴重影響油菜的形態建成，造成地上部營養體偏小，進而影響油菜的產量因子的發育和最后產量的形成[7]。因此，對油菜蕾薹期的抗旱性研究更有意義。

近年來在小麥[8]、大豆[9]、玉米[10]等作物中已經開展了較多抗旱相關性狀的QTL定位研究，但有關油菜抗旱QTL的研究還鮮見報道。其中王丹丹[11]以F2∶4群體為材料，采用復合區間作圖方法，對苗期葉綠素質量分數、葉片相對含水量、葉片保水力、可溶性糖質量分數、丙二醛質量分數5個耐旱相關性狀及其耐旱系數進行了QTL分析，共檢測到8個QTL。薦紅舉等[12]通過構建重組自交系高密度SNP遺傳圖譜，找到8個與抗旱相關的QTL位點。前人研究多以葉片脯氨酸含量、萎蔫指數、植株干重、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、光合速率等作為作物抗旱性狀鑒定指標[13-15]。然而，在育種實踐中往往需要用到更加簡單、直觀的形態指標來判斷植株的抗旱水平，包括產量、株高及葉片萎蔫指數等。研究這些抗旱相關性狀的遺傳基礎是開展抗旱育種的前提。因此，本研究針對長江流域春旱頻發的特點，利用抗旱能力差異較大的兩個甘藍型油菜親本構建了一個F2∶3群體，對甘藍型油菜蕾薹期抗旱相關性狀進行了初步的QTL定位，估計相應的QTL效應大小，以期為抗旱相關性狀分子標記輔助選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究用到的油菜抗旱親本QY8-1(P1)來源于秦優8號，已經過7代自交、選擇，形成純系。干旱敏感親本為滬油16號(P2)，也已經自交多代純合。這兩個親本的抗旱性經過發芽期、苗期及成株期的綜合鑒定，差異十分明顯[16]。以QY8-1為母本，與滬油16號雜交得到F1，從中選擇1株套袋自交得到F2，經進一步培育獲得了F2∶3群體，該群體由183個家系組成。

1.2 試驗設計

抗旱性鑒定試驗于2010年10月到2011年5月在干旱棚中進行。田間試驗采用裂區試驗設計，主區為水分處理(干旱脅迫和正常供水)，副區為不同基因型。處理內設置3個重復，每小區種植1行，隨機區組排列。整地前按1 500 kg·hm-2均勻施俄羅斯復合肥(中化化肥有限公司)，N、P、K的比例為16∶16∶16，播種后不再追肥。10月7日播種兩個親本及 183個F2∶3家系，每份材料播種一行。播種后立即均勻澆水，保證其正常發芽和生長。25 d后進行間苗和定苗，株、行距分別為0.1 m和0.3 m，行長2.4 m。

水分處理方式：利用噴灌設施進行精量分行供水，土壤含水量利用SM-5M土壤濕度傳感器進行實時監測，從現蕾期(即小區75%植株剝開主莖頂端1～2片小葉能見到明顯花蕾的時期)開始處理，當0～40 cm的土壤層平均含水量降低到15%時認為干旱脅迫開始(約需要3 d)，到抽薹期(即小區75%以上植株主莖伸長且主莖頂端離子葉節達10 cm為止)結束[16]，約持續30 d，干旱脅迫處理結束后立即恢復供水。對照區則充分供水，使0～40 cm的土壤層平均含水量保持在30%以上。田間管理按常規方法進行。

1.3 性狀考察

葉片萎蔫指數和植株鮮重的調查在干旱脅迫后30 d進行。首先以小區為單位，中午時分連續觀察并記載萎蔫指數。油菜萎蔫指數分為5 級，1級為無萎蔫(賦值為1.00)；2級為輕微萎蔫(<10%植株萎蔫，賦值為0.75)；3級為萎蔫(40%～70%植株萎蔫，賦值為0.50)；4級為明顯萎蔫(>90%植株萎蔫，賦值為0.25)；5級為嚴重萎蔫(葉片黃化、褐化或大部分葉片死亡或脫落，賦值為0.00)。萎蔫指數越小，其抗旱性就越差；反之萎蔫指數越大，則其抗旱性越強。

測完葉片萎蔫指數后，每行連續選取5株，連根拔起，立即用清水除凈根部泥土，濾紙吸干，用電子天平測定單株重量，取平均值后即為單株鮮重。抽薹高度在復水后5 d(即干旱脅迫開始后的35 d)調查，分別測量正常灌溉和干旱脅迫條件的單株抽薹高度，每家系選5株，最后計算平均值。各性狀的抗旱系數計算方法如下：

抗旱系數=干旱脅迫下的測定值/正常灌溉條件下的測定值。

1.4 DNA的提取

在親本和F2群體各單株中分別選取2.0 g葉片采用CTAB法[17]提取DNA，用分光光度計測定DNA濃度，調整到50 ng·μL-1后冰箱保存備用。

1.5 SRAP標記分析

SRAP引物由上海生工合成提供[18]。其中上游引物8條(Me01-Me08)，下游引物20條(Em01-Em20)(表1)，一共組成160對引物。PCR反應體系為：10×Taq Buffer(含Mg2+)1 μL、10 mmol·L-1dNTP 0.2 μL、50 ng·μL-1引物0.9 μL、5 U·μL-1Taq DNA多聚酶0.25 μL、50 ng·μL-1DNA模版0.5 μL，加ddH2O至10 μL。反應程序為：95℃變性3 min；94℃變性1 min，35℃復性30 s，72℃延伸1 min，5個循環；94℃變性1 min，50℃復性1 min，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。擴增產物在6%變性PAGE凝膠上分進行電泳檢測，銀染法顯色。

1.6 遺傳作圖和QTL分析

將LOD最小值設為2.0，應用軟件MapMaker3.0[19]構建甘藍型油菜遺傳連鎖圖譜。用Kosambi函數將重組值轉換為遺傳圖距，并進一步用MapDraw軟件畫出連鎖圖譜[20]。應用軟件WinQTLCart 2.5[21]的復合區間作圖法對抗旱相關性狀進行QTL定位分析。重復抽樣1 000次，取LOD值2.0為QTL存在的閾值，QTL的命名按“性狀+處理條件+序號”進行。

2 結果與分析

2.1 親本及群體的抗旱性表現

在干旱脅迫和正常灌溉條件下，比較了兩個親本P1(QY8-1)、P2(滬油16)及F2∶3群體的抗旱性。由表2所示，甘藍型油菜三個性狀在兩親本之間存在明顯差異。與正常灌溉相比，干旱脅迫下P1的抽薹高度下降了21.2%，而P2下降幅度高達59%，是P1的2.8倍。葉片萎蔫指數的對比更明顯，在正常條件下P1和P2都在0.98以上，但在干旱條件下P1略有下降(0.80)，而P2則大幅度下降到0.36，僅有前者的45%(0.36/0.80)。同樣，在干旱條件下單株鮮重也受到嚴重影響，P1、P2分別下降了52.5%和64.2%。以上結果表明，干旱對抽薹高度、單株鮮重以及葉片萎蔫指數等性狀的影響較大，而且存在基因型差異，其中親本P1的抗旱性較好，P2的抗旱性較差。

表1 本研究利用的SRAP引物序列

經干旱處理后，由親本P1和P2構建的F2∶3家系各性狀也明顯變化(表2)。其中，抽薹高度平均下降了53.6%，單株鮮重平均下降了55.3%，葉片萎蔫指數平均下降了52.6%。在干旱脅迫和正常供水兩種環境下，F2∶3家系的各性狀值為連續分布表明為多基因控制的數量性狀。正態分布檢測表明，這些性狀分布基本符合正態分布，適合于QTL分析。

表2甘藍型油菜親本及群體抗旱相關性狀的表現

Table 2 Evaluation of drought related traits in rapeseed parents and population

性狀Trait處理Treatment親本ParentQY8-1滬油16Huyou16F2∶3Family均值Mean最小值Min最大值Max方差Variance偏度Skewness峰度Kurtosis抽薹高度/cmShootheight單株鮮重/(Plant·g-1)Freshweight葉片萎蔫指數Leafwiltingindex灌溉Watered60.4020.0047.1015.4081.60182.400.23-0.41干旱Drought47.608.2021.801.6058.20160.800.73-0.08灌溉Watered275.40244.20270.80240.00299.80155.20-0.18-2.46干旱Drought130.8087.40120.9097.80148.2066.400.10-1.51灌溉Watered0.990.980.970.951.000.00.09-0.97干旱Drought0.800.360.460.100.890.10.18-1.30

葉片萎蔫指數是反映植物抗旱性最直觀的指標[22]。相關性分析表明，在干旱脅迫下F2∶3群體的葉片萎蔫指數與抽薹高度及單株鮮重均呈極顯著正相關，相關系數分別為0.829**和0.734**；單株鮮重也與抽薹高度呈極顯著正相關(r=0.734**)(表3)，由此可見，抽薹高度與單株鮮重也是衡量抗旱性的重要指標，而且這些性狀可能受到某些共同的遺傳控制。另外，上述性狀抗旱系數之間的相關系數更高，均在0.996以上(表3)，進一步說明了這三個性狀之間具有密切的關系。

表3 F2∶3群體在干旱脅迫下性狀(上三角)及其抗旱系數(下三角)間相關性分析

注：**表示在0.01水平上顯著。

Note：** represent statistically significant atP<0.01.

2.2 遺傳連鎖圖譜構建

在油菜親本P1和P2中共篩選了160對SRAP引物，擴增條帶數在5～46之間，多態性片段數量在1～13之間，平均為4.2條。按照多態性標記、多條帶清晰的原則，最終選擇了75對引物進行群體分析，共得到了388個多態性標記，平均每對引物組合產生5.2個標記。

對群體中檢測到的388個標記進行遺傳作圖，發現共有335個標記可以進入連鎖群，剩余的53個標記無法進入連鎖群。該遺傳圖譜包含了21個連鎖群，其中LG1包含的標記數目最多，達53個；LG21的標記數目最少，僅有4個。單個連鎖群的遺傳圖距在32.4～238.3 cM之間，整個連鎖遺傳圖譜長度為1661.9 cM，標記間的平均距離為4.96 cM，滿足QTL定位標記間距離小于15 cM的要求[23]。

2.3 抗旱相關性狀的QTL分析

利用復合區間作圖法，在正常灌溉和干旱脅迫下分別對抽薹高度、單株鮮重、葉片萎蔫指數及這些性狀的抗旱系數進行QTL分析，一共找到了28個QTL，分布在21個連鎖群中的14個連鎖群上(圖1)，可解釋的表現變異在1.1%～36.6%之間不等(表4)。

2.3.1 抽薹高度 共檢測到10個QTL位點，分別位于第1、5、9、10、12、15和19連鎖群上(圖1)。單個QTL的貢獻率在4.3%至36.6%之間，其中在干旱脅迫下6個，正常灌溉條件下2個，抗旱系數2個(表4)。qSH-W-1、qSH-W-2、qSH-D-1、qSH-D-3、qSH-DRI-2的加性效應均來自滬油16的增效作用，其它5個QTL的加性效應均來自QY8-1的增效作用。其中，在干旱脅迫下定位到的qSH-D-5位于第15連鎖群標，能解釋36.6%的表型變異，屬于主效QTL。利用抗旱系數檢測到的qSH-DRI-1與主效QTLqSH-D-5位于同一連鎖群，都位于Em07/Me04-6—Em02/Me20-3區間，但貢獻率僅有6.5%。

2.3.2 單株鮮重 共檢測到12個QTL位點，分別位于第2、8、11、12、13、16、19連鎖群上(圖1)。單個QTL的貢獻率在1.6%到11.2%之間。其中干旱脅迫下2個，正常灌溉條件下6個，抗旱系數4個(表4)。qFW-DRI-3、qFW-DRI-2、qFW-D-2、qFW-DRI-4的加性效應均來自QY8-1的增效作用，qFW-W-2的加性效應為0，其余的QTL的加性效應為負值。其中qFW-D-2的遺傳貢獻率最大(R2=8.7%)。正常灌溉下檢測到的qFW-W-3與利用抗旱系數檢測到的qFW-DRI-2都位于第11連鎖群的同一位置，貢獻率分別為4.9%和4.0%。

注：白色、紅色和藍色圖案分別代表正常供水、干旱處理和抗旱系數Note: White, red, and blue color indicate the watered condition, drought stress, and drought resistant index, respectively

注：q, QTL; SH, 抽薹高度; FW, 單株鮮重; LWI, 葉片萎蔫指數; W, 正常供水; D, 干旱處理; DRI, 抗旱系數。

Note: SH, shoot height; FW, plant fresh weight; LWI, leaf wilting index; W, water supply; D, drought stress; DRI, drought resistant index.

2.3.3 葉片萎蔫指數 共檢測到6個QTL位點，分別位于第4、8、15、16連鎖群上。單個QTL的遺傳貢獻率在1.1%到13.5%之間。其中干旱脅迫下檢測到2個，正常灌溉條件下3個，抗旱系數1個(表4)。除了qLWI-W-2和qLWI-D-2的加性效應是負值，其它QTL位點的加性效應都是正值，增效位點來源于親本QY8-1。在干旱脅迫下檢測到的qLWI-D-1能解釋5.2%的表型變異，位于第15連鎖群，相同位置還檢測到抗旱系數的QTLqLWI-DRI-1，其貢獻率為3.1%。同樣，在第16連鎖群的標記區間Em01/Me12-1—Em01/Me09-1也檢測到兩個重疊的QTL(qLWI-W-3和qLWI-D-2)，但貢獻率僅有1.1%～4.5%，屬于微效QTL。

3 討 論

在干旱脅迫下，兩個親本的性狀差異較明顯，例如QY8-1的抽薹高度為47.6 cm，而滬油16的抽薹高度僅有8.2 cm，明顯低于前者。另外兩個指標(單株鮮重和葉片萎蔫指數)也是如此，說明現蕾至抽薹時期的干旱對油菜的生長和發育產生重要影響，而且不同基因型對干旱脅迫的反應存在差異，其中QY8-1的抗旱性較好，滬油16的抗旱性較差。F2∶3群體中除了在干旱脅迫條件下的單株鮮重以外，其它各性狀在不同環境處理下均為超雙親表現，說明兩個親本間既存在增效基因又存在減效基因，通過基因的重新組合有望在群體后代中篩選到抗旱性顯著增強的新材料。

國內外有關甘藍型油菜抗旱相關性狀QTL研究報道較少。Li等[24]利用性狀差異大的甘藍型油菜親本構建了一個DH群體,利用該群體在苗期對株高、根長、地上部干重、根干重及總干重等性狀進行了QTL分析，在不同水分脅迫下共定位到51個QTL，其中利用抗旱系數為性狀共掃描到19個QTL。本研究利用F2∶3群體在抽薹期共定位到28個抗旱相關QTL，明顯少于上述報道。可能原因是兩者使用的群體類型不同，檢測時期不同，以及測定指標也不盡相同。另外，油菜在不同發育時期的抗旱性及其采用的應對策略也是變化的(陸光遠等，未發表)。本研究還發現了許多重疊的QTL(比如LG8、LG11、LG13、LG14、LG15、LG16和LG19上分別可測到2～4個重疊的QTL，見圖1)，一方面說明QTL檢測結果的可靠性，另一方面也說明部分QTL位點具有一因多效作用，即一個QTL可以同時控制多個性狀，這也部分解釋了抽薹高度、單株鮮重以及葉片萎蔫指數之間存在的高度相關性(表3)。Li等[24]也觀察到類似現象，他們發現株高抗旱系數、根干重抗旱系數以及總干重抗旱系數的QTL都定位在第1連鎖群的相同區域，而且這三個性狀之間也顯著相關。

4 結 論

利用一個甘藍型油菜F2∶3群體在抽薹期進行抗旱性鑒定和QTL分析，共檢測到28個QTL，其貢獻率在1.1%～36.6%之間。其中在LG15連鎖群上檢測到4個重疊的QTL，貢獻率最大為36.6%，在抗旱育種中應重點關注。在LG16連鎖群上也檢測到4個重疊的QTL，但貢獻率在8.1%以下，屬于微效QTL，但在育種選擇中也應予以考慮。

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