5-氮雜胞苷對低溫脅迫下黃瓜幼苗光合作用的影響

邢瀟晨，索琳格，肖春燕，劉苗苗，劉慧英，崔金霞

(石河子大學農學院園藝系，特色果蔬栽培生理與種植資源利用兵團重點實驗室， 新疆 石河子 832003)

DNA甲基化(DNA methylation)是一種常見和重要的表觀遺傳修飾形式，是在DNA甲基轉移酶(DNA methyl transferase, DNMT)的作用下，將S-腺苷-甲硫氨酸(S-daomet, SAM)的甲基基團轉移到胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)上，最常見的是轉移到C，形成5-甲基胞嘧啶(5 mC)，完成DNA的共價修飾，從而影響到DNA和蛋白質的相互作用，抑制基因的表達[1-2]。DNA甲基化不僅參與植物生長發育調控[3-4]，近期研究表明外界不良環境條件如干旱、鹽害、冷害等非生物脅迫能夠誘導植物基因組DNA甲基化水平和狀態(半甲基化、全甲基化、去甲基化)發生變化，從而影響到植物基因表達和轉座子的轉座活性，進而對其生物遺傳信息進行調節，為植物適應不良環境創造有利的條件，而逆境脅迫結束后，DNA甲基化又恢復到脅迫之前的水平，避免基因不必要的活躍表達與能量浪費[5]。

植物體內基因組DNA甲基化水平的變化與不同溫度環境脅迫有關，低溫及高鹽脅迫誘導抗逆相關基因編碼區去甲基化，增加基因的表達量以應對環境脅迫[6]；低溫脅迫條件下，許多種植物都會發生基因組DNA甲基化水平的降低。如在低溫脅迫條件下，玉米幼苗根部組織的基因組DNA甲基化水平降低了至少10%[7]。5℃冷處理水稻48 h后，基因組甲基化模式和水平發生明顯改變[8]。低溫脅迫下甲基化水平降低之后，植物基因組轉座子活性被激活，例如金魚草的Tam3轉座子，15℃的低溫脅迫誘導了Tam3序列的甲基化水平特異性變化，即發生了去甲基化，并激活了轉座子的轉錄，25℃時甲基化受到強烈抑制[9]。低溫脅迫往往通過誘導抗逆基因甲基化水平的變化，來改變轉錄組的轉錄表達，以提高在低溫脅迫下的抵抗力和適應力，Hashida等研究表明低溫脅迫條件下，轉座酶在DNA復制和細胞分裂結束后立即結合于Tam3轉座子上，導致了DNA甲基化水平降低[10]。Shan等利用MSAP法研究發現低溫處理后，玉米幼苗全基因組DNA甲基化多態性占總條帶的32.6%～34.8%，大多數片段發生了去甲基化現象，對特異性片段回收測序，進行BLAST比對，結果表明這些片段的同源染色體涉及到許多過程，包括激素調節，低溫反應，光合作用和轉座子激活等[11]。

5-氮雜胞苷(5-azaC)是目前植物上研究和應用最多的DNA甲基化抑制劑之一，可以降低基因組甲基化水平[12]，在植物的表型性狀[13-14]，植物春化作用和開花[15-17]等方面都有研究。但對于5-azaC降低基因組甲基化水平在植物抗逆機理中的作用相關研究較少，有研究表明合適濃度的5-azaC處理可以減緩白菜幼苗在高溫脅迫下的生長量、POD活性和蛋白質含量的降低幅度，同時降低MDA含量和細胞膜透性[18]。

黃瓜是一種喜溫作物，其所有組織對低溫都敏感[19]。10℃～12℃以下低溫即能引起黃瓜生理活動的失調，呈現生理障礙[20]，黃瓜光合器官的受損也表現的較為明顯[21]。低溫能降低植物光合效率、改變光合色素組成、抑制葉綠體發育等，因此本試驗以黃瓜為材料，噴施不同濃度5-azaC，對低溫脅迫下黃瓜幼苗葉片氣體交換參數、光化學效率、光能分配、相對電導率等進行了一些探索，以期為降低基因組DNA甲基化水平在植物耐冷性中的作用機理提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料及其處理

以“津研四號”黃瓜品種為試材，5-azaC藥劑購自美國Sigma公司。試驗于2013年在石河子大學農學院試驗站溫室中進行。

黃瓜種子經55℃溫湯浸種處理后，于28℃條件下在人工智能光照培養箱中進行避光培養催芽，選擇剛剛萌動、芽勢一致的種子播于72孔穴盤內，子葉展平時分苗于120 cm×110 cm的育苗缽中，基質為草炭∶蛭石=2∶1(v∶v)，間隔5 d澆灌一次霍格蘭營養液。幼苗長出兩片真葉時，選取大小、形態一致且無病蟲害的幼苗進行預處理。

5-azaC濃度設：CK、100、250、500、800、1 000、2 000 μmol·L-1和5 000 μmol·L-1。處理期間，每天早上10∶00，整株幼苗均勻噴施5-azaC，同時CK噴灑蒸餾水，每天一次，連續噴3 d，然后置于光照培養箱中進行低溫處理，晝夜溫度設定為10℃ /6℃，光照時間為12 h，光照度為300 μmol·m-2·s-1。分別于低溫處理0 h(即低溫處理前)、低溫處理24 h和低溫處理48 h三個時間段進行取樣，每個處理重復3次。

1.2 細胞膜透性的測定

細胞膜透性采用相對電導法[22]。

1.3 氣體交換參數的測定

用英國PP-Systems公司生產的CIRAS-2型光合儀在光照培養箱內測定300 μmol·m-2·s-1下黃瓜幼苗最佳功能葉片(上數第2葉)的光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)和胞間CO2濃度(Ci)。

1.4 葉綠素熒光猝滅

在低溫0 h、24 h和48 h，黃瓜幼苗在光照培養箱內暗適應25 min，用英國Hansatech公司生產的FMS-2脈沖調制式葉綠素熒光儀測定葉綠素熒光參數。根據Demming-Adams和Adams[23]及FMS-2型葉綠素熒光儀使用手冊進行計算，公式如下：

暗適應下PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)=(Fm-Fo)/Fm；

PSⅡ實際光化學效率(ΦPSⅡ)=(Fm′-Fs)/Fm′；

PSⅡ天線轉化效率Fv′/Fm′=(Fm′-Fo′)/Fm′；

光化學猝滅系數qP=(Fm′-Fs)/(Fm′-Fo′)；

非光化學猝滅系數NPQ=(Fm-Fm′)/Fm′；

電子傳遞速率ETR=ΦPSⅡ×PFD×0.84×0.5，其中PFD是被吸收的光通量密度(μmol·m-2·s-1)，0.5代表光能在兩個光系統間的分配系數，0.84指入射到葉片表面的光能平均有84%被葉片吸收[24]。

利用熒光參數計算PSⅡ吸收光能分配和光系統激發能分配的情況[25-26]：PSⅡ吸收光能用于光化學反應的相對份額(P)=Fv′/Fm′×qP×100%；用于天線熱耗散的相對份額(D)=(1-Fv′/Fm′)×100%；用于反應中心耗散的相對份額(Ex)=Fv′/Fm′×(1-qP)×100%。

光系統Ⅰ(PSⅠ)與PSⅡ間激發能分配不平衡性(β/α-1)=(1-f)/f(其中f為PSⅡ反應中心開放程度，f=(Fm-Fs)/(Fm-Fo)；α、β分別為PSⅠ和PSⅡ的激發能分配系數)。

1.5 數據統計分析

采用Excel軟件進行數據的統計分析，計算平均值、標準差；用SPSS 17.0軟件對數據進行單因素方差分析，并用 Duncan’s檢驗法對顯著性差異(P<0.05)進行比較；用OriginLab 7.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 低溫下不同濃度5-azaC處理對黃瓜幼苗細胞膜透性的影響

由圖1可知，低溫0 h(低溫處理前)，不同濃度5-azaC處理的黃瓜幼苗葉片相對電導率比較一致，隨著低溫處理時間的逐漸延長，各處理相對電導率的值也逐漸增大。低溫脅迫24 h和48 h，與各自對照相比，100～800 μmol·L-1的5-azaC處理降低了相對電導率值，其中噴施濃度為500 μmol·L-1的5-azaC處理的相對電導率降低幅度最大，比各自的對照分別減小了24.94%和27.98%。說明噴施合適濃度的5-azaC處理可以緩解低溫弱光對黃瓜幼苗細胞質膜結構和功能造成的影響。

2.2 低溫下不同濃度5-azaC處理對黃瓜幼苗光合作用的影響

從圖2(A，B，C，D)可以看出，與低溫0 h相比，低溫24 h和48 h，不同濃度5-azaC處理的Pn、Gs和Tr呈現下降的趨勢，Ci呈現上升的趨勢；在低溫0 h、24 h和48 h，不同濃度的5-azaC處理表現出明顯的濃度效應，從100～500 μmol·L-1處理的Pn、Gs和Tr值逐漸上升，Ci值逐漸下降，500～5 000 μmol·L-1的5-azaC處理Pn、Gs和Tr值逐漸下降，Ci值逐漸上升，其中500 μmol·L-1的5-azaC處理是拐點，表明低濃度的5-azaC處理在低溫處理前和低溫下可以增強黃瓜的光合作用，而高濃度5-azaC處理則表現出抑制作用。

圖1低溫下不同溫度5-azaC對黃瓜幼苗葉片相對電導率的影響

Fig.1 Effects of 5-azaC concentrations on relative electrical conductivity of cucumber seedling under low temperature

2.3 低溫下不同濃度5-azaC處理對黃瓜幼苗葉綠素熒光參數的影響

由圖3(A)可知，進行低溫處理后，隨著低溫時間的增長，黃瓜幼苗葉片的Fv′/Fm′值逐漸降低，低溫24 h和48 h的對照與0 h的CK相比，分別降低了3.46%和5.26%，這表明低溫處理促使PSⅡ天線激發能的捕獲效率降低。噴施5-azaC可以減緩黃瓜幼苗葉片的Fv′/Fm′值降低的速度。低溫處理24 h，500～800 μmol·L-1的5-azaC處理與其對照相比Fv′/Fm′值分別提高了3.94%和3.67%。低溫處理48 h，500～800 μmol·L-1的處理Fv′/Fm′值比CK分別提高了2.79%和2.80%。Fv/Fm的下降，表明PSⅡ受到損傷。

由圖3(B)可知，低溫0 h，與CK相比，經5-azaC處理的幼苗Fv/Fm值升高，但都在0.80～0.85之間，表明此時黃瓜葉片的PSⅡ未受到任何損傷，且經5-azaC處理，能提高PSⅡ反應中心內能轉化效率。與低溫處理0 h相比，低溫24 h和48 h黃瓜幼苗葉片的Fv/Fm值都降低，表明此時黃瓜葉片已經受到光抑制。與各自對照相比，在100～800 μmol·L-1的濃度范圍內，隨著濃度的增加，Fv/Fm值也逐漸提高，經500 μmol·L-1的5-azaC處理的葉片Fv/Fm值提高最明顯，分別提高了0.98%和1.11%。

圖2 低溫下不同濃度5-azaC對黃瓜幼苗葉片光合作用的影響

圖3低溫下不同濃度的5-azaC對黃瓜幼苗葉片葉綠素熒光參數的影響

Fig.3 Effects of 5-azaC concentrations on chlorophyll fluorescence parameters of cucumber seedlings under low temperature

由圖3(C)可知，與低溫0 h相比，低溫24 h和48 h，ΦPSII逐漸下降。但經5-azaC處理可提高低溫脅迫下黃瓜幼苗葉片的ΦPSII值，且在100～1 000 μmol·L-1濃度范圍內隨著濃度的增加而提高，500～800 μmol·L-1的處理ΦPSII值提高最明顯。1 000 μmol·L-1之后的處理使ΦPSII值急劇下降，說明高濃度的5-azaC處理促使PSⅡ光化學活性降低。

由圖3(D)可知，與低溫0 h相比，低溫24 h和48 h黃瓜幼苗ΦPSII和ETR都顯著降低，說明黃瓜幼苗經低溫處理，PSⅡ光化學活性降低，光合電子傳遞受到限制。低溫下不同濃度的5-azaC引起的光合電子傳遞速率(ETR)的變化趨勢與ΦPSII相似。

2.4 低溫下不同濃度5-azaC處理對黃瓜幼苗葉綠素熒光猝滅的影響

葉綠素熒光猝滅包括光化學猝滅(qP)和非光化學猝滅(NPQ)。光化學猝滅系數(qP)表示總PSⅡ反應中心中開放的反應中心所占比例的指標，在一定程度上反映了植物光合活性的高低。由圖4(A)可知，與低溫0 h相比，低溫處理24 h和48 h的qP值持續下降，表明葉片捕獲的激發能中用于推動光化學反應的部分所占比例下降，植物光合活性降低。低溫0 h、低溫24 h和48 h，不同濃度5-azaC處理的黃瓜幼苗qP值呈現先升高后降低的趨勢，500～800 μmol·L-15-azaC處理表現最為明顯，qP值達到峰值。這表明100～800 μmol·L-15-azaC 處理能夠減緩低溫下黃瓜葉片光合活性降低的速度，提高葉片捕獲的激發能中用于推動光化學反應的部分所占比例。

NPQ反映了植物耗散過剩光能為熱的能力，常用于衡量過剩激發能的耗散情況，NPQ逐漸增大，說明葉片為保護光合機構免遭破壞迅速啟動熱耗散，以耗散過剩能量。由圖4(B)可以看出，與低溫0 h對照相比，低溫處理24 h和48 h黃瓜幼苗葉片NPQ值急劇增大，分別增大了153.83%和250.48%。低溫24 h和48 h，與各自的對照相比，不同濃度5-azaC處理使NPQ值呈現先減小后增大的趨勢。最明顯的是低溫24 h，500 μmol·L-1的處理急劇減少，與其對照相比，減少了46.10%。

Y(NO)是PSⅡ處于非調節性能量耗散的量子產量，若Y(NO)較高，表明光化學能量轉換和保護性的調節機制(如熱耗散)不足以將植物吸收的光能完全消耗掉，即入射光強超過了植物能接受的程度，因此Y(NO)可以作為光損傷的重要指標。由圖4(C)可知，與低溫0 h相比，隨著低溫時間的延長，Y(NO)值逐漸升高，表明低溫時間的長短與黃瓜葉片的光損傷程度成正比。噴施一定濃度的5-azaC可減緩低溫造成的黃瓜葉片光損傷程度。其中500～800 μmol·L-1的處理效果最明顯。

圖4低溫下不同濃度5-azaC對黃瓜 幼苗葉片qP、NPQ和Y(NO)的影響

Fig.4 Effects of 5-azaC concentrations onqP,NPQandY(NO) of cucumber seedlings under low temperature

2.5 低溫下不同濃度5-azaC處理對黃瓜幼苗光化學速率、天線熱耗散速率及其分配比例影響

利用熒光參數可將植物葉片吸收的光能分為三個部分：天線上耗散的能量D、反應中心由非光化學反應耗散的能量Ex、用于光化學反應的部分P。通過計算它們占總吸收光能的百分比，可以了解植物的光能利用能力。

由圖5(A，B，C)可知，與低溫0 h相比，低溫處理24 h和49 h，黃瓜幼苗葉片反應中心用于光化學反應的能量(P)逐漸降低，用于反應中心由非光化學反應耗散的能量(Ex)和天線上耗散的能量(D)逐漸增高。其中噴施500～800 μmol·L-1的5-azaC處理與對照相比P值逐漸升高。與此相對應，說明噴施5-azaC可以提高黃瓜幼苗葉片反應中心用于光化學反應的能量所占的比例。

PSⅠ和PSⅡ間激發能分配不平衡性可用β/α-1表示。由圖5(D)可知，黃瓜幼苗葉片PSⅠ和PSⅡ間激發能分配偏離平衡程度與低溫處理時間成正比，即隨低溫處理時間增加，黃瓜幼苗葉片偏離平衡的程度越嚴重。從不同濃度處理下葉片PSⅠ和PSⅡ間激發能分配平衡偏離系數(β/α-1)來看，500～800 μmol·L-1的5-azaC處理促使黃瓜幼苗葉片PSⅠ和PSⅡ間激發能分配偏離平衡程度較小，有利于兩個光系統之間彼此傳遞的協調。

圖5低溫下不同濃度的5-azaC對黃瓜幼苗葉片光能分配和光系統激發能分配的影響

Fig.5 Effects of 5-azaC concentrations on the allocation of absorbed light of cucumber seedlings under low temperature

3 討 論

植物的低溫傷害始于細胞膜系統。細胞膜透性增大將會導致一系列代謝變化，最終造成細胞死亡[27]。本研究結果表明，隨著低溫時間的延長，與低溫0 h相比，低溫24 h和48 h，黃瓜幼苗葉片相對電導率值明顯增加，說明已經對黃瓜幼苗膜系統造成了傷害，而500 μmol·L-1的5-azaC處理顯著降低了低溫對細胞膜的傷害，因而起到了抗冷的作用。這可能與500 μmol·L-1的5-azaC處理能夠顯著提高黃瓜葉片SOD、CAT、APX和GR抗氧化酶活性清除過多活性氧有關[28]。

低溫能夠直接影響植物光合器官的結構和活性，也可以通過對植物生理過程作用間接影響植物光合作用。低溫導致植物光合作用下降的因素有氣孔因素也有非氣孔因素。Farquhar等[29]認為植物葉片凈光合速率下降的主要原因有兩方面：(1) 由于氣孔導度下降，CO2的供應受到阻滯；(2) 植物葉片葉肉細胞光合性能下降，導致葉肉細胞同化CO2的能力下降，這樣就會導致胞間CO2濃度升高。本試驗結果表明，低溫下，黃瓜幼苗葉片的Pn、ΦPSⅡ和Fv/Fm明顯降低，胞間CO2濃度(Ci)顯著升高(P<0.05)，由此可以看出Pn值下降是由非氣孔因素限制。同時也說明葉片的光能轉換效率降低，增加了過剩激發能，從而引起光抑制，葉片的光合機構受到傷害。這與前人的研究結果[30]相一致。本試驗中，低溫下噴施500～800 μmol·L-1的5-azaC預處理的Pn、ΦPSⅡ和Fv/Fm的增幅較大，說明適宜濃度的5-azaC能夠通過調節低溫下黃瓜幼苗葉片的光合功能來減輕低溫對植株的傷害。

葉綠體吸收的光能除用于光合作用外，還有一部分在形成同化力之前以熱耗散的形式流失和以熒光的形式重新發射出來。低溫下，光化學猝滅系數(qP)呈降低趨勢。但噴施500～800 μmol·L-1的5-azaC處理可以提高低溫下黃瓜幼苗葉片的qP值，即提高了葉片捕獲的激發能中用于推動光化學反應的部分所占比例。而非光化學猝滅系數(NPQ)呈現升高的趨勢，說明黃瓜葉片為保護光合機構免遭破壞迅速啟動熱耗散，以耗散過剩能量，是植物適應低溫的體現。Y(NO)的趨勢與NPQ一致，但噴施500～800 μmol·L-1的5-azaC可減緩NPQ下降程度，減緩低溫對黃瓜幼苗葉片造成的光損傷。

本試驗中通過測算葉片的光化學速率、天線耗散速率及其占總吸收光能的比例，了解黃瓜葉片在低溫下的光能利用能力。結果表明，低溫條件下，吸收光強分配于光化學反應的部分降低，而用于天線熱耗散比例和反應中心由非光化學反應耗散的能量逐漸升高，且主要以光化學反應的部分為主要光能分配途徑。經5-azaC處理的黃瓜幼苗葉片與低溫對照相比，吸收光強分配于光化學反應的部分先減少(低溫24 h)后增加(低溫48 h)，而天線熱耗散比例先增加后減少，這種變化可以認為低溫處理24 h，植物對逆境的一種適應能力，激發能天線熱耗散比例增加，低溫處理48 h，反應中心用于非光化學反應耗散的能量開始升高，這部分能量由于反應中心的關閉不能用于光化學反應，只能作為過剩光能由反應中心以非光學反應的形式加以耗散，在耗散過程中，能量可能會傳遞至O2，形成破壞性極大的單線態1O2[31]，并形成各種活性氧分子，對葉綠體和細胞造成氧化損傷。從黃瓜幼苗葉片PSⅠ和PSⅡ間激發能分配平衡偏離系數(β/α-1)來看，隨著低溫處理時間積累，(β/α-1)逐漸增大，說明植物葉片的兩個光系統間激發能分配已嚴重失衡。經500～1 000 μmol·L-1的5-azaC處理與低溫對照相比偏離平衡的程度較小，說明適宜的濃度可以在一定程度上減緩兩個光系統間激發能失衡程度。

綜上所述，500～800 μmol·L-1的5-azaC處理可明顯緩解低溫對黃瓜幼苗葉片細胞膜的傷害，并且在一定程度上抑制了膜脂過氧化作用，降低葉片細胞傷害率；500～800 μmol·L-1的5-azaC處理可促使黃瓜幼苗在低溫下的凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)的升高，胞間CO2濃度(Ci)的降低；同時也促進PSⅡ的最大光化學效率(Fv/Fm)、實際光化學效率(ΦPSⅡ)、光合電子傳遞效率(ETR)和光化學猝滅系數(qP)的升高，非光化學猝滅系數(NPQ)和葉片光化學猝滅參數[Y(NO)]的降低。上述結果表明，低溫下，500～800 μmol·L-1的5-azaC處理有助于維持黃瓜葉片中較高的光系統活性和碳同化能力，從而保護光合系統，降低低溫脅迫對植物的損傷，提高黃瓜幼苗的耐冷性。但5-azaC處理對黃瓜幼苗低溫下光合特性的影響機理及對以后黃瓜植株生長、產量及品質等的影響，還有待進一步研究。

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