NaCl脅迫對接種AMF費菜生長和葉綠素含量及熒光參數的影響

王一鳴，唐 劍，龍勝舉，趙英鵬，賀忠群

(四川農業大學園藝學院， 四川 成都 61130)

費菜(SedumaizoonL.)，別名景天三七、養心菜，景天科，是一種既可食用也可藥用的多年生草本開花植物，可以作為野菜食用，具有清熱涼血、滋養肝臟的功能，尤其是對心臟病有特殊療效，同時也可作為園林綠化、公路綠化植物，成為近年來的重要研究對象[1]。

土壤鹽漬化已經成為許多國家阻礙農業發展的重要因素，根據聯合國糧食及農業組織記錄資料顯示，地球鹽堿土面積已經達到9.5×108hm2，其中有1.0×106hm2土地因為土壤鹽漬化已無法耕種[2]。當前，隨著工農業的發展，土地越來越稀缺，鹽漬土復墾投資持續增加[3]，鹽堿地改造已經開始被高度重視。

叢枝菌根真菌與植物根系可以共生，它一方面直接影響植物的生理機能，另一方面也可以影響宿主植物的生長[4]。近年來，試驗發現叢枝菌根真菌能提高大部分植物耐鹽性，將AMF應用到鹽堿地改良是創新性的解決方案，如AMF和植物根系的共生體菌根(AM)可以修復有機污染土壤和重金屬土壤[4-5]。另外，農業生產利用AMF還可以降低化學復合肥料的使用[6]。因此探索AMF對費菜的影響無論是對于推廣費菜還是改良鹽堿地都尤為重要。

1 材料與方法

1.1 材料

供試費菜由四川農業大學實踐教學基地提供。試驗使用基質為粘土、腐葉土、河沙按體積比1∶1∶1混合配置的營養土。

試驗使用的叢枝菌根真菌Glomus mosseae(GMA)和Glomus mosseae-3(GMH)由中國農業科學院蔬菜研究所提供，各菌劑內AMF孢子含量約為312個孢子/20 g菌劑。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 2016年5月選取一年生費菜近地端4～5 cm長且粗細一致的莖，帶3～4個節，采用800倍的多菌靈溶液進行滅菌處理，滅菌后備用。供試基質過10目篩，高溫消毒，冷卻后備用。營養缽的規格為Φ12 cm，用75%的酒精滅菌。其它接種工具均使用75%的酒精擦拭滅菌。在營養缽底部裝入100 g滅菌基質，均勻撒入100 g菌劑，上層再覆蓋基質150 g。CK、GMH、GMA各接種110缽，CK為接種滅菌菌劑100 g。扦插費菜枝條，每缽3株，澆透水，使用托盤對滲出水進行回收，避免菌劑流失。通過澆灌1/2霍格蘭營養液進行常規管理。扦插接菌50 d后，進行NaCl處理。試驗設置5個NaCl濃度梯度，分別為0、8、12、16、20 g·kg-1，按照干土重量配成鹽溶液分別處理接有GMA、GMH和CK的費菜，共計15個處理，每個處理20缽。

1.2.2 項目測定及方法

(1) AMF侵染率測定：扦插接菌45 d時對AMF侵染率進行測定，將土壤置于水中，取出費菜的根系，用水洗凈，剪成長約 1 cm的根段，置于FAA溶液中固定24 h，采用曲利苯藍染色法[7]觀察菌根侵染情況，統計菌根侵染率。

菌根侵染率(%)=叢枝菌根侵染根段長度/觀察根段長度×100%

(2) 鹽害指數測定：處理28 d參照秦紅艷[8]的方法，觀察不同NaCl濃度處理下葉片形態、色澤的變化。受害分級標準：0級：葉片伸展，生長正常；1級：少量葉片邊緣干枯或黃化；2級：50%葉片及少量莖段干枯或黃化；3級：80%以上葉片黃化，50%以上莖段干枯；4級：完全死亡。鹽害指數(%)=∑(代表級數×株數)/(最高級值×總株數)×100%。

(3) 葉綠素含量測定：處理第28 d測定，葉綠素含量測定參考張以順[9]的實驗方法，選取自頂向下第3～5片葉，計算出葉綠素含量。

(4) 葉綠素熒光參數測定：鹽處理后28 d，選取各處理費菜自頂部向下第3片完全展開葉，采用PAM-2500熒光儀(Walz，Effeltrich，Germany)，利用2030-B葉夾測定葉綠素熒光參數。首先將葉片暗適應30 min，參照Cuddy[10]的方法測定熒光誘導曲線的慢速下降動力學并進行淬滅分析。得到Fm′、Fo′、ETR，繼而算出Fv/Fo、Fv/Fm、ΦPSⅡ、NPQ、qP。每處理測定重復3次。

(5) SOD的測定：采用氮藍四唑發測定(NBT法)，選取自頂部向下第3片完全展開葉進行測定。

(6) 生長及形態指標測定：每處理取10株完整植株進行根長、株高、干重的測定，其中采用游標卡尺測定最長根和最長莖的長度，干重采用烘干稱重法。依據根干重和地上部分干重算出根冠比=根干重/地上部分干重。處理第28 d測定。

1.3 數據統計與分析

采用Microsoft Excel 2013進行數據統計及繪圖，用SPSS軟件計算試驗數據的平均值和標準差，采用最小顯著差異法(LSD)進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 AMF對費菜的侵染情況

由表1可以看出， GMH和GMA對費菜都有較高的侵染率，接種GMA的侵染率高于接種GMH植株且有顯著性差異，說明叢枝菌根真菌與費菜具有較好的共生關系，可以進一步探索AMF對費菜耐鹽性的影響。

表1 AMF對費菜的侵染率

注：不同字母表示差異達5%顯著水平。

Note：Different letters index indicate significant difference at 5% level.

2.2 NaCl脅迫下費菜接菌苗的鹽害指數

由表2分析可知，CK處理在NaCl處理濃度為8 g·kg-1時即有鹽害跡象，但鹽害指數較低，隨著鹽濃度升高，鹽害指數逐漸增加，在NaCl處理濃度為20 g·kg-1時，植株在第14 d即枯萎。接種AMF的費菜與CK處理相比，明顯增強了植株對鹽脅迫的耐受性，在12 g·kg-1才有較小的鹽害指數，超過這一濃度鹽害指數也大幅上升。在相同處理條件下，接種GMA的費菜表現出比接種GMH的費菜更低的鹽害指數，說明GMA與GMH相比，提高費菜耐鹽性的能力更強。

2.3 NaCl脅迫下AMF對費菜生長的影響

由圖1可知，費菜根長隨鹽脅迫濃度升高而呈先增后減的趨勢。在接種GMH和GMA條件下，費菜根長在NaCl處理濃度為12 g·kg-1時達到峰值。在鹽濃度低于8 g·kg-1的處理下，接種GMH、GMA費菜根長均小于同濃度條件下的CK植株。在濃度大于12 g·kg-1的NaCl脅迫條件下，隨著鹽處理濃度升高，CK植株的根長逐漸低于接種AMF的費菜根長，說明在較高的鹽脅迫下，AMF可以在一定程度上緩解鹽脅迫對植株根系的傷害，且接種GMA的費菜根系表現出更強的耐鹽性。

表2 NaCl脅迫下費菜的鹽害指數/%

植株的株高變化與根長相似，也基本呈現出先升高后降低的趨勢，同時接種AMF的費菜的株高顯著高于CK處理。其中接種GMH的費菜株高在8 g·kg-1時達到最大值，相比CK提高了29.79%，接種GMA的費菜株高在12 g·kg-1時達到最大值，相比CK提高了42.13%。說明AMF對植株的生長具有促進作用，同時可提高費菜的耐鹽性，且GMA更有優勢。

由圖2可知，在不同NaCl處理濃度下，鹽濃度越大，根系受到傷害越大，根冠比越小。CK和GMH的根冠比峰值出現在8 g·kg-1處理濃度，接種GMA的費菜根冠比在處理濃度為12 g·kg-1時達到峰值。在未受到鹽脅迫時，接種了GMA的費菜根系活力比CK高78%，接種GMH的根系活力比CK高16%。隨著NaCl濃度升高，根系活力呈現先升高后降低的趨勢，其中CK在8 g·kg-1時根系活力最強，接種AMF的費菜在12 g·kg-1時根系活力最強。其中接種GMA的根系活力均顯著高出GMH和CK，說明接種GMA可顯著提高費菜的根系活力。

圖1 NaCl脅迫下AMF對費菜株高和根長的影響

圖2 NaCl脅迫下AMF對費菜根冠比和根系活力的影響

Fig.2 Effects of AMF on activity ofSedumaizoonL. root and its root/shoot ratio

2.4 NaCl脅迫下AMF對費菜葉綠素熒光參數的影響

Fo為充分暗適應的光合機構的初始熒光強度，是PSⅡ處于完全開放時的熒光產量，PSⅡ天線熱耗散的增加常導致Fo的降低，PSⅡ反應中心的破壞或者可逆失活則引起Fo的增加[11]。Fm為暗適應葉片最大熒光產量，是PSⅡ處于完全關閉時的熒光產量，可以反映通過PSⅡ的電子傳遞情況[12]。Fv/Fm是充分暗適應的光合機構潛在的PSⅡ光化學效率，其大小可以反映光抑制的程度[13]。

研究發現(圖3)，隨著鹽處理濃度的增加，Fo先增大后減小，CK的Fo峰值出現在8 g·kg-1，而接種了GMH或者GMA的Fo峰值出現在12 g·kg-1。Fm、Fv/Fm、Fv/Fo均呈現出一個下降的趨勢，當到達20 g·kg-1時，CK植株枯萎，接種AMF的植株的各項參數均在一個較低的水平處理，表明PSⅡ反應中心隨著鹽脅迫程度的加重開始發生可逆失活或者被破壞，光合電子傳遞活性遭到抑制。并且隨著鹽脅迫程度的增加，實際光化學效率ΦPSⅡ的下降幅度要大于最大光化學效率Fv/Fm的下降幅度，表明光抑制現象從NaCl處理濃度為8 g·kg-1時就已經產生。

光化學淬滅(qP)代表PSⅡ原初電子受體QA的氧化還原狀態和PSⅡ開放中心的數目，其值越大，PSⅡ的電子傳遞活性越高[15]。非光化學淬滅(NPQ)是通過調節性光保護機制耗散為熱的能量與被耗散為熱量和發出熒光的能量的比值，代表著葉片熱耗散功能的強弱及光合機構的損傷程度。隨著鹽脅迫程度的加重，qP表現出逐漸下降，NPQ則是先上升(圖3)，NaCl處理濃度為16 g·kg-1時達到峰值后開始下降。表明隨著鹽脅迫程度的加重，會導致qP的顯著下降，對費菜PSⅡ反應中心的電子傳遞活性造成嚴重的影響。同時NPQ的先上升后下降，表明植株通過增加熱耗散來緩解鹽脅迫對光合作用的影響，當鹽脅迫進一步加重，達到20 g·kg-1時，NPQ開始降低，表明此時PSⅡ遭到了嚴重破壞，導致熱耗散能力開始降低。

而接種AMF的植株的各項參數在相同的鹽濃度下均要顯著高于CK處理，說明接種AMF對于提高植株的光合能力、增加植株的熱耗散能力以及在鹽脅迫的條件下保護植株的光合機構具有一定的作用。

2.5 NaCl脅迫下AMF對費菜電子傳遞速率的影響

ETR(電子傳遞速率)反映了電子傳遞活性的高低。研究發現(圖4)，在未受到鹽脅迫時，接種AMF的費菜ETR均明顯高于CK，表明AMF對于植株的生長具有促進作用，增加了植物對養分的吸收能力。當受到鹽脅迫時ETR下降，并且這種趨勢隨著處理濃度的升高而增大。當NaCl處理濃度為16 g·kg-1時，CK較未受到脅迫時ETR下降46%，GMH較未受到脅迫時ETR下降29.4%，GMA較未受到脅迫時ETR下降29.2%。相同鹽處理濃度下，三處理ETR有下列大小關系：GMA>GMH>CK，表明在鹽脅迫的過程中AMF對于植株具有一定的緩解作用。

2.6 NaCl脅迫下費菜葉綠素含量與SOD的變化

分析圖5可知，隨著NaCl處理濃度的升高，費菜葉綠素總量呈現先上升后下降的趨勢，SOD則表現出持續上升的趨勢，但是CK處理在大于8 g·kg-1的NaCl處理濃度后SOD的含量開始下降。表明隨著鹽脅迫的加重，超氧化物大量產生，光合機構開始受到損傷，為了保護光合機構免遭破壞，植株通過增加葉片內葉綠素的含量，以應對NaCl脅迫帶來的生理紊亂。當處理濃度超過12 g·kg-1后，SOD含量繼續上升，但是上升幅度顯著下降，表明SOD已無法及時清除大量產生的超氧化物，外在表現則是葉綠素含量的顯著下降。在相同濃度處理中，接種AMF的費菜各項指標均顯著高于CK處理，說明接種AMF可降低費菜葉綠素在鹽脅迫下被破壞的程度，提高費菜的耐鹽能力。

注：初始熒光Fo: Changes of minimal fluorescence; 最大熒光Fm： Maximal fluorescence; 實際光化學效率ΦPSⅡ: Actual photochemical efficiency; 最大光化學效率Fv/Fm: Maximal photochemical efficiency; 光化學猝滅系數qP: Photochemical quenching; 非光化學猝滅系數NPQ： Non photochemical quenching

圖3 NaCl脅迫下AMF對費菜Fo、Fm、ΦPSⅡ、Fv/Fm、qP、NPQ的影響

圖4 NaCl脅迫下AMF對費菜ETR的影響

圖5 NaCl脅迫下費菜葉綠素含量和SOD的變化

Fig.5 Change between chlorophyll, Minimal fluorescence and SOD ofSedumaizoonL. under NaCl stress

3 討 論

對鹽堿地改造以及如何提高植物耐鹽性一直是人們研究的重點。叢枝菌根真菌通過與植物形成共生關系，可以增強植物的耐鹽能力。許多研究表明接種AMF對植物的生長均有不同程度的促進作用，在植株干物重、株高、葉面積、葉綠素等方面均有一定體現，且不同菌種間差異很大[15]。本實驗所使用的叢枝菌根真菌屬于球囊霉屬下的兩個種，而球囊霉屬的菌種分布廣泛，在所有的生態系統中均有分布[16]。實驗結果表明，GMA比GMH對費菜有更高的侵染率，且接種AMF后，費菜根長、株高、根冠比與CK相比均有顯著增加，這與曹巖坡[17]用AMF對鹽脅迫下蘆筍幼苗生長影響的結果相一致。在NaCl處理濃度為8 g·kg-1時，接種GMH和GMA費菜的株高與同濃度CK處理相比分別提高了29.7%和35.2%。在12 g·kg-1的NaCl處理濃度下，接種GMH和GMA費菜的鹽害指數與同濃度的CK處理相比降低了46.13%和56.14%。這表明AMF可以在一定程度上緩解鹽脅迫對植物造成的傷害，提高植物的耐鹽性，其中以GMA的效果最為明顯。

葉綠素是光合作用光能捕獲的物質基礎，起到吸收、轉移、轉換光能的作用[18]。在本試驗中接種了GMA和GMH的費菜在各個鹽脅迫濃度下的葉綠素總含量均顯著高于CK，且伴隨 NaCl處理濃度的升高，葉綠素含量先增加后減小，與熒光參數Fo的變化相一致，同時伴隨著SOD含量的升高，說明低濃度NaCl(≤8 g·kg-1)處理，植物PSⅡ反應中心以可逆性失活耗散過剩光能和增加SOD含量來清除超氧化物達到保護光合機構免受破壞，同時促進了費菜葉綠素合成來緩解NaCl脅迫帶來的生理紊亂。高濃度NaCl脅迫處理導致葉綠素遭到破壞，有可能是因為脅迫使植物葉綠素酶活性增強分解了葉綠素的緣故[19]。這表明AMF可以增加費菜葉綠素的含量來緩解鹽脅迫對植株造成的損傷。

葉綠素熒光參數的測定可以更好地反映出光合作用“內在性”的變化特點。目前葉綠素熒光已經被較多地應用于探測逆境脅迫下對植物光合作用的影響與機理[20-21]。但是對于費菜的研究目前還較少。本研究發現，隨著鹽脅迫程度的增加，光化學淬滅(qP)逐漸降低，實際光化學效率ΦPSⅡ的下降幅度大于最大光化學效率Fv/Fm的下降幅度，初始熒光Fo在12 g·kg-1的NaCl處理濃度之前呈現上升趨勢，表明光抑制現象從NaCl處理濃度為8 g·kg-1時就已經產生，同時PSⅡ反應中心開始出現可逆失活，以及降伴隨著非光化學淬滅(NPQ)的升高，增加熱耗散以減少PSⅡ反應中心過剩的光能積累，保護光合機構免受破壞。接種AMF的植株在NaCl處理濃度超過12 g·kg-1時，Fo開始顯著降低，同時非光化學淬滅(NPQ)進一步上升，在處理濃度為16 g·kg-1時達到最大而后開始降低，表明隨著鹽脅迫的加重，葉片的PSⅡ反應中心開始受到破壞，熱耗散能力受到抑制，光合機構遭到破壞，這與總葉綠素含量的變化趨勢相符合。而CK處理在處理濃度為8 g·kg-1時Fo便開始顯著降低。電子傳遞速率(ETR)隨著鹽濃度的升高逐漸降低，這也進一步表明植物葉片通過熱耗散、光抑制以及PSⅡ反應中心的可逆失活來應對鹽脅迫下對光合機構的破壞。本試驗中，NaCl脅迫可導致葉綠素熒光參數(除初始熒光Fo)各項指標的降低，接種AMF的植株(特別是GMA)各項指標均顯著高于CK處理。表明AMF能顯著減輕鹽害對費菜光合機構的破壞、反應中心的光合電子傳遞活性的抑制，從而提高費菜的光合能力以及對鹽害的抗性。

綜上所述，費菜在NaCl處理濃度超過12 g·kg-1時，受到嚴重的鹽脅迫，鹽害指數達到67.51%，接種GMH、GMA可使該濃度下的鹽害指數下降46.13%和56.14%，這表明AMF可以保護植物光合機構免受嚴重破壞并促進植株光合作用和植株的生長，以提高費菜對于鹽脅迫的耐受性。因此，將AMF用于費菜生產與園林綠化中將大大提高其對土壤鹽環境的適應性。

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