鹽脅迫下寧夏枸杞根系Na+、K+平衡及抑制劑對其影響的研究

朱志明，毛桂蓮，許 興，王 盛，鄭 蕊，楊淑娟

(1.寧夏大學農學院， 寧夏 銀川 750021； 2.寧夏大學生命科學學院， 寧夏 銀川 750021；3.寧夏大學西北退化生態系統恢復與重建教育部重點實驗室， 寧夏 銀川 750021)

近年來，土壤鹽漬化問題日益突出，全球近20%的耕地都不同程度的受到土壤鹽堿化的影響，成為農業生產及生態環境中一個全球性問題[1]。鹽脅迫對植物的傷害主要表現為Na+在細胞中大量累積，使細胞內代謝活動受到抑制，離子平衡被破壞[2]。高Na+通過直接干擾和抑制細胞質膜對營養元素(K+和Ca2+)的吸收和轉運，造成離子失衡和營養缺乏。有研究表明,在鹽脅迫下植物能否維持細胞內的離子平衡，尤其是Na+/K+平衡，是其耐鹽性強弱的決定性因素[3]。Zhu J K等[4]研究了植物細胞Na+/K+平衡的信號轉導和分子調控網絡；檀葉青等[5]對胡楊細胞Na+/K+平衡及其耐鹽機理方面做了大量研究，揭示了耐鹽林木通過其質膜上的Na+/H+逆向運輸系統，將胞內過量Na+排出胞外，同時抑制K+外排，保持細胞內較低的Na+/K+，從而增加其耐鹽性。鹽生植物寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)具有耐鹽堿、耐旱、繁殖能力強等特點，是寧夏特色優勢產業之一，對于其耐鹽性及耐鹽機理，毛桂蓮等[6]研究了NaHCO3脅迫下3種灌木Na+、K+、Ca2+的吸收及轉運，以及堿脅迫對寧夏枸杞葉中Na+、K+、Ca2+動態變化的影響[7]。但對于NaCl脅迫下寧夏枸杞根系Na+/K+調控機制，以及耐鹽機理仍未明確，且目前大多研究集中在離子平衡靜態方面，對其動態變化研究鮮有涉及。非損傷微測技術在不損傷植物體的情況下，能獲得持續、穩定、活體離子流信息，為研究離子動態變化提供了便利。本試驗采用非損傷微測技術，探討鹽脅迫下寧夏枸杞根系Na+、K+離子平衡及抑制劑對其影響，以期為寧夏枸杞耐鹽機理及鹽堿地枸杞栽培研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為寧夏育新枸杞公司育種基地的枸杞品種“寧杞1號”。

1.2 材料培養及處理

取一年生“寧杞1號”硬枝扦插苗為試驗材料，采用沙土(沙土比1∶1)于2016年4月在寧夏大學農科基地溫室培養，定期澆水，保持土壤濕度。并每兩周澆一次全營養液，于2016年5月中旬選取長勢良好一致的土培苗轉入含1/4濃度Hoagland營養液的水培瓶(口徑15 cm，高25 cm)中進行水培，每瓶5株，定期更換新鮮營養液。整個試驗期間按水培常規管理方法進行管理。待新根長出后，選取長勢一致的幼苗，在含1/4濃度Hoagland營養液中加入鹽溶液進行處理。每天更換含預定處理鹽濃度的營養液以保證處理期間鹽濃度保持不變。每個處理重復10瓶。具體處理方法見表1。

表1 試驗處理方法

注：表中處理D、E是將NaCl處理7 d的枸杞根系放在抑制劑中孵育30 min后測定離子流速。

Note: The treatments of D and E in the table are the determination of the ion velocity after the NaCl treatment of 7 d in the root of theLyciumbarbarumL. and incubated with 30 min inhibitor.

1.3 測定項目及方法

1.3.1 Na+、K+含量的測定 分別取處理24 h、7 d后的枸杞根系烘干粉碎后稱取50 mg干樣，用10 ml去離子水沸水條件下浸提60 min，采用原子分光光度計(TAS-990,Purkinje General,北京)測定根系中Na+、K+含量[8]。每個處理重復5次。

1.3.2 Na+、K+離子流速的測定 利用非損傷微測技術(NMT)檢測(旭月(北京)科技有限公司NMS系統(Younger USA LLC, Amherst, MA 01002, USA))測定根細胞Na+、K+離子流，具體檢測方法及原理參照相關文獻[9-11]。

測定過程中將選擇性離子電極在尖端不觸碰根表面的情況下盡量靠近根面。選擇性離子電極以此為起點，沿x、y、z軸三個方向進行三維立體往復測試。電極運動一次間距(從近待測根表面一端到遠待測根表面一端)為30 μm，運動頻率為0.3～0.5 Hz。測試離子流速可通過Fick′s 擴散法則計算得出，公式如下:

J=-D(dc/dx)

式中，J為x方向的離子流；D為在特定介質中離子或分子擴散常數；dc/dx為離子濃度梯度。離子流數據根據旭月公司提供的Mage Flux在線軟件( http: www．youngerusa．com)計算得出。本試驗中陽離子外流表示為正值，內流為負值，且所得數據是凈離子流速，即內流與外流相抵消后的離子流速。

K+流速測定：微電極前端灌充有15～25 μm選擇性的K+的液態交換劑，其后灌充10 mm左右的電解液柱(100 mmol·L-1KCl)，將電極固定器上的Ag/AgCl絲從電極后面插入，使其與電解液接觸，固體電極作為參比電極。玻璃微電極需要校正后使用。K+校正液為0.05、0.1 mmol·L-1和0.5 mmol·L-1緩沖液(K+測試液為0.1 mmol·L-1)。

Na+流速測定：微電極前端灌充15～25 μm選擇性Na+的液態交換劑，其后灌充有10 mm左右的電解液柱(250 mmol·L-1NaCl)，玻璃微電極器上的Ag/AgCl絲從電極后面插入，使其與電解液接觸，固體電極作為參比電極。玻璃微電極需要校正后使用。Na+校正液為0.5、0.9 mmol·L-1和5.0 mmol·L-1緩沖液(Na+測試液為0.9 mmol·L-1)。

H+流速測定：微電極前端灌充15～25 μm選擇性的H+的液態交換劑，其后灌充有10 mm左右的電解液柱(40 mmol·L-1KH2PO4+15 mmol·L-1NaCl)，玻璃微電極器上的Ag/AgCl絲從電極后面插入，使其與電解液接觸，固體電極作為參比電極。玻璃微電極需要校正后使用。H+校正液為0.1 mM NaCl、0.1 mM MgCl2、0.1 mM CaCl2和0.5 mM KCl(H+測試液為0.1 mM NaCl，0.1 mM MgCl2，0.1 mM CaCl2，0.5 mM KCl和2.5%蔗糖，用HCl和KOH調節pH至5.5)。

1.4 數據處理

離子流檢測數據由旭月(北京)科技有限公司的統計軟件完成，數據統計分析和作圖采用Excel和SPSS1 7.0軟件進行。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫下枸杞根系中Na+、K+含量

在鹽處理濃度(50、100 mmol·L-1)相同條件下，隨著脅迫時間的增加，枸杞根系中Na+含量總體呈升高趨勢，其中7 d，100 mmol·L-1處理的Na+含量最高，與其它處理之間的差異顯著。在相同的脅迫時間內(24 h)，隨著脅迫濃度的升高，不同處理間的Na+含量差異不顯著。當處理時間為7 d時，Na+含量總體呈上升趨勢，50 mmol·L-1處理與對照差異不顯著，100 mmol·L-1處理與對照及50 mmol·L-1處理差異均達到顯著水平。同一脅迫時間(24 h)內，隨著脅迫濃度的增加，K+含量呈先升后降趨勢，不同處理之間的差異顯著，且顯著高于對照。處理時間為7 d時兩種鹽濃度處理間的差異不顯著；與對照相比，兩種鹽處理的K+含量均顯著升高。同一脅迫濃度下(50、100 mmol·L-1)，隨脅迫時間的增加，K+含量呈緩慢上升趨勢；長時間的鹽處理增加了枸杞根系中K+含量。

圖1不同濃度鹽處理下鈉離子、鉀離子含量

Fig.1 Na+and K+contents under different treatments

2.2 NaCl脅迫下枸杞根系中Na+/K+

相同的脅迫時間內，隨著脅迫濃度的增加,寧夏枸杞根系中Na+/K+呈先降后升趨勢，24 h,50 mmol·L-1處理下Na+/K+最低，比對照下降了38.6%，7 d,100 mmol·L-1處理下Na+/K+比對照下降了18.2%，比同濃度24 h處理增加了16.7%。不同濃度處理與對照的差異顯著，Na+/K+在24 h處理下顯著低于對照(圖2)。相同脅迫濃度下，隨著脅迫時間的增加Na+/K+呈上升趨勢。

2.3 不同NaCl處理下Na+、K+、H+離子轉運

NaCl脅迫下不同處理Na+外排速率均顯著高于對照(CK)，外排明顯增加。24 h,50 mmol·L-1處理的平均凈Na+外排速率最高，較對照增加了83.6%(圖3a)。相同脅迫時間內，隨著脅迫濃度的增加，平均凈Na+外排速率表現為先升后降趨勢，且始終高于對照，與對照差異顯著。隨著脅迫時間的增加，同一脅迫濃度下Na+外排速率降低，脅迫24 h后，不同濃度處理之間的差異顯著，處理時間增加到7 d后，不同濃度處理與對照相比差異顯著(圖3b)。NaCl脅迫下K+外排明顯增加，顯著高于對照(圖3c)。在相同的脅迫時間內(24 h)，隨著脅迫濃度的增加，平均凈K+流速先增加，后下降，不同濃度間的差異顯著。脅迫時間為7 d時，隨脅迫濃度增加K+外排持續增加，處理間的差異達到顯著水平。7 d,100 mmol·L-1處理的平均凈K+外排速率最大，較對照增加了94.8%，較同時間的50 mmol·L-1處理增加了67.3%。在相同脅迫時間內(7 d)，隨著脅迫濃度的增加，K+流速呈先下降后上升趨勢(圖3 d)。H+內流速率(除24 h,50 mmol·L-1處理外)隨著脅迫時間和脅迫濃度的增加而顯著增加，處理間的差異達到顯著水平(圖3e)。

圖2不同處理下枸杞根系中Na+/K+

Fig.2 Na+/K+under different treatments

圖3 NaCl脅迫下枸杞根系凈Na+、K+、H+轉運

Fig.3 Effect of NaCl stress on Na+,K+,H+fluxes in root ofLyciumbarbarumL.

注：圖中數據表示10 min內枸杞根系凈Na+、K+、H+動態轉運(a,c,e圖)及10 min內平均Na+、K+、H+轉運速率(b,d,f圖)。圖中數據為每個測定區域內數個測定位置的離子流速的平均值。

Note: Data are expressed as the Na+,K+,H+flux kinetics on the roots ofLyciumbarbarumL.(a,c,e figure) and the average Na+、K+、H+fluxes ofLyciumbarbarumL. in ten minutes(b,d,f figure). Data are the average of the ion velocity of a plurality of measurement positions in each measurement area.

2.4 兩種抑制劑處理下Na+、H+離子流速

圖4結果表明，與100 mmol·L-1不加抑制劑處理相比，兩種抑制劑處理下凈Na+外排速率顯著降低，兩者差異顯著，釩酸鈉處理的凈Na+外排速率較100 mmol·L-1不加抑制劑的處理降低了74.3%，差異達到顯著水平。阿米洛利處理的凈Na+外排速率較100 mmol·L-1不加抑制劑的處理降低了77.8%，兩者差異顯著。 與100 mmol·L-1不加抑制劑處理相比，釩酸鈉處理的凈H+內流速率降低了15.7%，差異達到顯著水平。兩種抑制劑顯著降低了Na+外排及H+內流速率；礬酸鈉抑制劑對H+內流抑制作用更加明顯，阿米洛利抑制劑對Na+外排速率影響更明顯，兩種抑制劑對枸杞根系Na+外排及H+內流具有顯著調控作用。

圖4抑制劑阿米洛利與礬酸鈉處理的枸杞根系Na+,H+轉運

Fig.4 Effect of amiloride and vanadate on net Na+,H+fluxes in root ofLyciumbarbarumL.

注：圖中數據為每個測定區域內數個測定位置的離子流速的平均值
Note: Data are the average of the ion fluxes of a plurality of measurement positions in each measurement area.

3 討論與結論

植物體內積累過多Na+會對其產生毒害作用，耐鹽植物通過調節細胞內的離子平衡，降低離子毒害進而增加其耐鹽性[12]。初始鹽脅迫下，枸杞根系中Na+含量增加緩慢，與對照差異不顯著，隨著脅迫時間及濃度的增加，Na+含量顯著增加。結合Na+流速結果分析，初始鹽脅迫下Na+外排迅速增加，隨著脅迫時間及濃度的增加外排減慢，但始終高于對照，表現為明顯的外排。上述結果表明，在短期低濃度鹽脅迫下，寧夏枸杞根細胞為了降低Na+毒害，將胞內過多的Na+排出胞外，維持細胞內較低的Na+濃度，從而降低了Na+毒害。

前人研究表明,K+在植物抗鹽性中起到重要作用,而高濃度Na+又會誘導組織內K+含量降低，從而造成鹽害[11]。本試驗中，與未經處理的CK相比，鹽脅迫下寧夏枸杞根系中的K+含量會顯著增加，K+外流先增加后降低，分析其原因可能是由于初始脅迫下Na+進入細胞會誘發質膜電位去極化[13]，并激活質膜外向整流型K+通道(DA-KORCs)和非選擇性陽離子通道(DA-NSCCs)[14]，從而引起K+外流。隨著鹽脅迫時間延長和脅迫濃度的增加，質膜H+-ATPase降低了質膜的去極化程度,減少了通過去極化激活通道的流失。K+外流由快減慢，進而使胞內含有較高的K+濃度。

植物在鹽脅迫環境下維持細胞內較低的Na+/K+平衡對其抗鹽性具有重要作用。對耐鹽胡楊的研究表明主要通過增加Na+外排，限制K+外流來調節鹽脅迫下組織或細胞中的Na+/K+平衡[4，15-16]。本試驗中，寧夏枸杞根系中Na+/K+在NaCl脅迫下顯著低于對照，表明寧夏枸杞根系能夠調節胞內Na+/K+平衡，促進胞內Na+外排，同時抑制K+外流，維持細胞內較低的Na+/K+，進而增加其耐鹽性。本試驗研究結果與前人在耐鹽胡楊上的研究結果吻合。

抑制劑試驗結果顯示，質膜Na+/H+逆向轉運蛋白抑制劑阿米洛利(Amiloride)和質膜H+-ATPase 抑制劑礬酸鈉(Vanadate)都顯著降低了短期鹽脅迫下寧夏枸杞根系的Na+外流和H+內流，表明在鹽脅迫下質膜H+-ATPase水解ATP產生的能量將H+泵出，激活了Na+/H+逆向轉運體的活性，H+進入胞內的同時，Na+排出胞外[17]。試驗結果進一步說明，寧夏枸杞根系能夠將胞內過多的Na+排出胞外是源于其體內的Na+/H+逆向運輸。此研究結果與前人在木欖植物的研究成果相似[11]。

綜合上述，寧夏枸杞根系調控Na+/K+平衡可能有兩種方式：一是借助于質膜上的Na+/H+逆向轉運蛋白載體將胞質中過量的Na+外排，質膜上的H+-ATPase水解ATP產生能量，將H+從細胞質中泵出,從而產生跨質膜的H+電化學勢梯度，H+順著電化學勢梯度進入細胞的同時,Na+逆著電化學勢梯度被排出細胞，從而保持細胞內較低的Na+含量；另一方面可能是通過提高質膜H+泵活性來減少K+外流。提高質膜H+泵活性可以在為Na+跨膜外排提供濃度梯度的同時，降低質膜去極化程度，進而減少K+外流。從而保持細胞內較低的Na+/K+，提高其耐鹽性。

本試驗在前人研究基礎上，采用目前較為先進的非損傷微測技術測定了活體植物離子流，可以更為準確地揭示植物體內離子流動態變化規律及植物耐鹽機理。然而植物耐受鹽脅迫是一個復雜的生理過程，本試驗僅涉及了鹽脅迫下枸杞根系離子含量及其動態變化，對于其莖葉中離子變化尚未涉及，在后續研究中可進一步設置試驗進行深入探討。

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