干旱脅迫下灰色鏈霉菌對桔梗幼苗根際土壤酶活性、養分及微生物的影響

李堆淑，何念武，冀玉良

(商洛學院 生物醫藥與食品工程學院， 陜西 商洛 726000)

1 材料與方法

1.1 材料

灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)：購于中國工業微生物菌種保藏管理中心；桔梗種子來自陜西省商洛市天士力有限公司。

1.2 培養基

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂18.0 g，水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

高氏一號培養基：KNO31.0 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、K2HPO40.5 g、淀粉20.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、瓊脂18.0 g、NaCl 0.5 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

馬鈴薯培養基(PDA)：馬鈴薯300 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL、自然pH。

種子培養基：可溶性淀粉20 g、酵母膏5 g、蛋白胨5 g、NaCl 5 g、K2HPO41 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.2。

發酵培養基：玉米粉20 g、黃豆餅粉15 g、CaCl20.2 g、MgSO40.2 g、NaCl 2.5 g、K2HPO42 g、檸檬酸鈉2 g、硫酸銨0.75 g(溶解后加入)、Na2HPO42 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1.3 方法

1.3.1 發酵液的制備與濃度的配制 在活化的斜面灰色鏈霉菌菌種中加無菌水5 mL，刮下培養好的孢子，倒入裝有適量玻璃珠的錐形瓶內，震蕩15 min，打散孢子，制成一定濃度的孢子懸液，吸取1 mL菌懸液接種于三角瓶液體種子培養基中，于28℃，130 r·min-1的恒溫培養振蕩器中培養3 d后，按10%的接種量接于三角瓶(裝有玻璃球)發酵培養基中，于28℃，130 r·min-1的恒溫培養振蕩器中培養5～7 d。將灰色鏈霉菌發酵液的原液配制成不同濃度(稀釋為0,10,50,100,150倍，其中稀釋為100倍的發酵液的菌數為1×108cfu·mL-1)，備用。

1.3.2 桔梗的培養與處理 選取大小均勻、無病蟲害的桔梗種子，用3%濃度的KMnO4浸泡消毒30 min，再用蒸餾水沖洗干凈后自然曬干，備用。將直徑9 cm的培養皿洗凈烘干并鋪上雙層濾紙，然后加入10 mL蒸餾水，將桔梗種子放入，每皿50粒，在25℃、濕度為85.5%的人工氣候箱中培養，每天補加蒸餾水以保持濾紙濕潤。待桔梗幼苗生長至大約0.2 cm長度移栽至裝有沙質土壤的小花盆中，每盆(直徑15 cm×高度15 cm)土量為2.5 kg，將不同濃度的灰色鏈霉菌發酵液200 mL分別與花盆中的土攪拌，無菌水作為對照(CK)，土壤的持水量控制在45%左右(采用環刀法測定)，每盆15株，共60盆，擺放在實驗室樓頂的平臺上培養，生長至四葉期時，分別于7、14、21、28、35 d取桔梗根際土壤(0～20 cm)，檢測不同時間桔梗幼苗根際土壤酶活性變化，篩選最佳濃度的灰色鏈霉菌發酵液處理的桔梗根際土壤，測定土壤理化性質和微生物數量。

1.3.3 土壤酶活性測定 參考關松蔭[16]的方法測定土壤酶活性，蔗糖酶活性測定用3,5-二硝基水楊酸比色法，以24 h后1 g干土生成葡萄糖毫克數表示。脲酶活性測定用苯酚鈉比色法，以24 h后1 g土壤中NH3-N的毫克數表示。過氧化氫酶活性用高錳酸鉀滴定法測定，以每克干土1 h內消耗的0.1 mol·L-1KMnO4溶液體積數表示。纖維素酶活性測定用3,5-二硝基水楊酸比色法，以72 h后1 g干土生成葡萄糖毫克數表示。蛋白酶活性測定用茚三酮比色法，以24 h后1 g土壤中的氨基氮的毫克數表示。

1.3.4 土壤理化性質測定 有機質含量采用重鉻酸鉀容量法測定，全氮含量采用濃硫酸—硫酸銅—硫酸鉀—硒消解的凱氏定氮法測定，有效磷含量采用濃硫酸—高氯酸消解硫酸鉬銻抗比色法測定，速效鉀含量采用1.0 mol·L-1CH3COONH4浸提-火焰光度計法測定。

1.3.5 土壤微生物數量測定 采用稀釋平板計數法[17]，以土壤懸濁液稀釋10-6接種于牛肉蛋蛋白胨瓊脂培養基，24～48 h統計細菌數量，土壤懸濁液稀釋10-4接種于高氏一號瓊脂培養基，5～7 d統計放線菌數量，土壤懸濁液稀釋10-2接種于PDA瓊脂培養基，3～5 d統計真菌數量。

1.3.6 數據處理 采用Excel 2010和SPSS 17.0多重比較的Duncan進行整理和分析數據。

2 結果與分析

2.1 灰色鏈霉菌發酵液對干旱脅迫的桔梗根際土壤活性的影響

2.1.1 灰色鏈霉菌發酵液對干旱脅迫的桔梗根際土壤蔗糖酶活性的影響 將不同濃度灰色鏈霉菌菌株發酵液加入干旱脅迫的桔梗幼苗根際土壤，不同時間內測定桔梗土壤根際蔗糖酶活性。如表1所示，在桔梗育苗過程中，各組處理根際土壤蔗糖酶活性的變化動態規律基本相似。隨著灰色鏈霉菌發酵液濃度稀釋倍數的增加，桔梗根際土壤蔗糖酶活性也在增加，發酵液濃度稀釋到100倍時，在7～35 d桔梗根際土壤蔗糖酶活性均顯著高于對應時間的其它處理，并且在第14天，原液濃度稀釋100倍時，桔梗根際土壤蔗糖酶活性達到峰值，為0.798±0.040 mg·g-1，比CK、灰色鏈霉菌稀釋0，10，20，50，150倍的峰值分別高68%、12.55%、8.87%、7.98%、45.89%。用同種溶液濃度處理的桔梗根際土壤，在不同時間桔梗根際土壤蔗糖酶活性變化趨勢為先升高后降低。說明低濃度的灰色鏈霉菌菌株發酵液對桔梗根際土壤蔗糖酶活性有一定的促進作用，還能緩解桔梗幼苗受干旱脅迫。因此，不同灰色鏈霉菌發酵液通過誘導桔梗根際土壤，可以提高灰色鏈霉菌菌株發酵液中的土壤肥力。

表1 灰色鏈霉菌發酵液對干旱脅迫的桔梗根際土壤蔗糖酶活性的影響

注:同列不同小寫字母表示顯著差異(P<0.05),下同。

Note: Different small letters within the same column mean significant difference(P<0.05), the same as below.

2.1.2 灰色鏈霉菌發酵液對干旱脅迫的桔梗根際土壤脲酶活性的影響 將不同濃度灰色鏈霉菌菌株發酵液加入干旱脅迫的桔梗幼苗根際土壤，不同時間內測定桔梗土壤根際脲酶活性。如表2所示，在不同濃度灰色鏈霉菌發酵液處理條件下，各組處理在7～35 d內桔梗根際土壤脲酶活性均有顯著影響。隨著灰色鏈霉菌發酵液稀釋倍數的增加，桔梗根際土壤脲酶活性不斷增加，灰色鏈霉菌發酵液稀釋到100倍時，桔梗根際土壤脲酶活性均達到了峰值，隨之桔梗根際土壤脲酶活性有下降趨勢。但是用6種溶液處理的桔梗根際土壤脲酶活性隨著時間的延長均顯著增高(P<0.05)。處理第35天時，用灰色鏈霉菌發酵液稀釋100倍處理的桔梗根際土壤脲酶活性的峰值最高(11.616±0.012 mg·g-1)，比CK、灰色鏈霉菌發酵液稀釋0、10、20、50、150倍分別升高了12.63%、6.64%、5.48%、3.37%、7.70%。可見經過灰色鏈霉菌發酵液處理的桔梗根際土壤肥力在7～35 d不斷地增強，還能緩解桔梗幼苗受干旱脅迫。

2.1.3 灰色鏈霉菌發酵液對干旱脅迫的桔梗根際土壤過氧化氫酶活性的影響 將不同濃度灰色鏈霉菌菌株發酵液加入干旱脅迫的桔梗幼苗根際土壤，不同時間內測定桔梗土壤根際過氧化氫酶活性。如表3所示，在不同濃度灰色鏈霉菌發酵液處理條件下，各組處理在7～35 d內桔梗根際土壤過氧化氫酶活性均有顯著影響。各處理的桔梗根際土壤過氧化氫酶(CAT)的活性均顯著地高于CK，隨著各處理時間的延長桔梗根際土壤過氧化氫酶活性均先升高后下降。CK的過氧化氫酶活性在處理后的28 d達到峰值(4.537±0.002 mg·g-1)，其它處理均是在處理后的第21天達到峰值，其中灰色鏈霉菌菌株發酵液稀釋100倍處理的桔梗根際土壤過氧化氫酶活性達到最大值(5.060±0.056 mg·g-1)，分別比CK、灰色鏈霉菌發酵液稀釋0、10、50、150倍的峰值分別提高了11.53%、7.67%、4.63%、1.87%、6.53%。可見，用灰色鏈霉菌發酵液稀釋100倍能更有效地誘導一系列防御機制保護桔梗根際土壤免受氧化脅迫，但過量的過氧化氫則導致過氧化氫酶損失。可見，灰色鏈霉菌發酵液能緩解桔梗幼苗受干旱脅迫。

表2 灰色鏈霉菌發酵液對干旱脅迫的桔梗根際土壤脲酶活性的影響

表3 灰色鏈霉菌發酵液對干旱脅迫的桔梗根際土壤過氧化氫酶活性的影響

2.1.4 灰色鏈霉菌發酵液對干旱脅迫的桔梗根際土壤纖維素酶活性的影響 將不同濃度灰色鏈霉菌菌株發酵液加入干旱脅迫的桔梗幼苗根際土壤，不同時間內測定桔梗土壤根際纖維素酶活性。如表4所示，干旱脅迫的桔梗根際土壤纖維素酶活性較小，在不同濃度灰色鏈霉菌發酵液處理條件下，各組處理在7～35 d內桔梗根際土壤纖維素酶活性變化較顯著(P<0.05)。各處理的桔梗根際土壤纖維素酶活性均顯著高于CK，施加灰色鏈霉菌發酵液能使桔梗根際土壤纖維素酶活性提前達到峰值。隨著桔梗的生長，不同濃度的灰色鏈霉菌發酵液處理的桔梗根際土壤纖維素酶活性均在處理后的第28天達到峰值，而CK在第35天達到峰值。從整體看，用灰色鏈霉菌發酵液稀釋100倍處理的桔梗根際土壤纖維素酶活性在7～35 d內均高于其它處理的對應時間的纖維素酶活性。用灰色鏈霉菌發酵液稀釋100倍處理的桔梗根際土壤纖維素酶活性峰值(0.897±0.021 mg·g-1)，分別比CK、灰色鏈霉菌發酵液稀釋0、10、50、150倍的峰值分別提高了128.24%、85.71%、34.48%、22.37%、30.57%。土壤纖維素酶分解的纖維素越多，土壤肥力就越高，作物產量也越高，可見，灰色鏈霉菌發酵液能很好地促進桔梗根際土壤分解纖維素。

2.1.5 灰色鏈霉菌發酵液對干旱脅迫的桔梗根際土壤蛋白酶活性的影響 將不同濃度灰色鏈霉菌菌株發酵液加入桔梗幼苗的根際土壤，不同時間內測定桔梗土壤根際土壤蛋白酶活性。如表5所示，在不同濃度灰色鏈霉菌發酵液處理條件下，各組處理在7～35 d內桔梗根際土壤蛋白酶活性變化顯著。用灰色鏈霉菌發酵液處理的桔梗根際土壤蛋白酶活性隨著桔梗生育期的延長呈先升高后降低的變化趨勢，但CK的桔梗根際土壤蛋白酶活性在7～35 d內一直升高，并且在同一生育期桔梗根際土壤蛋白酶活性總是低于其它處理，土壤中蛋白酶活性反映了土壤中氮素營養的轉化狀況，說明CK處理的土壤中的氮素水平較低。用灰色鏈霉菌菌株發酵液稀釋100倍處理的桔梗根際土壤蛋白酶活性峰值(1.748±0.028 mg·g-1)，分別比CK、灰色鏈霉菌菌株發酵液0、10、50、150倍的峰值分別提高了43.51%、33.33%、34.67%、27.50%、23.56%。從整體看，用灰色鏈霉菌菌株發酵液稀釋100倍處理的桔梗根際土壤蛋白酶活性，在不同生長時間均比對應的其它處理的桔梗根際土壤蛋白酶活性顯著提高(P<0.05)，說明了土壤肥力越高，土壤供應養分的能力越強，桔梗幼苗生長越好。可見，灰色鏈霉菌發酵液可以緩解桔梗幼苗受干旱脅迫。

表4 灰色鏈霉菌發酵液對干旱脅迫的桔梗根際土壤纖維素酶活性的影響

表5 灰色鏈霉菌發酵液對干旱脅迫的桔梗根際土壤蛋白酶活性的影響

2.2 灰色鏈霉菌發酵液對干旱脅迫的桔梗根際土壤理化性質的影響

如表6可見，用稀釋100倍的灰色鏈霉菌發酵液處理干旱脅迫的桔梗幼苗根際土壤，在0～35 d內桔梗根際土壤肥力因素的變化趨勢基本一致。隨著灰色鏈霉菌發酵液處理時間的延長，土壤有機質、全氮、有效磷和速效鉀含量均不斷增加，在第35天時，土壤有機質、全氮、有效磷和速效鉀含量均達到最高值，分別比CK升高了280.13%、99.15%、60%和60.12%。

表6 灰色鏈霉菌發酵液(稀釋100倍)對干旱脅迫的桔梗根際土壤理化性質的影響

2.3 灰色鏈霉菌發酵液對干旱脅迫的桔梗根際土壤微生物的影響

如表7可見，用稀釋100倍的灰色鏈霉菌發酵液處理干旱脅迫的桔梗根際土壤，在0～35 d內桔梗根際土壤微生物群落的數量細菌占優勢。隨著處理時間的延長，細菌的數量一直增加，而放線菌和真菌的數量先升高后降低。在桔梗根際土壤處理的第35天時細菌數量最多比未處理土壤的細菌數量增加了355.43%，在桔梗根際土壤處理的第28天時放線菌和真菌數量均達到最高值，分別比未處理土壤的放線菌和真菌數量增加了253.70%和223.38%。可見，用稀釋100倍的灰色鏈霉菌發酵液處理桔梗根際土壤，土壤中微生物群落在整個生長過程變化差異顯著(P<0.05)，并且細菌數量的增長分別比放線菌和真菌快101.73個和132.05個百分點。

2.4 桔梗根際土壤酶、土壤理化性質、土壤微生物的相關性

如表8可見，用稀釋100倍的灰色鏈霉菌發酵液處理干旱脅迫的桔梗根際土壤，在0～35 d內桔梗根際土壤酶活性、土壤肥力、微生物之間存在一定的相關性。土壤酶活性與土壤酶活性之間的相關性表現為：蔗糖酶與過氧化氫酶正相關顯著(r=0.849，P<0.05)，脲酶與纖維素酶正相關顯著(r=0.825，P<0.05)，其它土壤酶之間相關但差異不顯著(P>0.05)。土壤酶活性與土壤肥力含量、微生物數量的相關性表現為：脲酶與有機質、全氮、有效磷、速效鉀含量和細菌數量分別為正相關且極顯著(P<0.01)；纖維素酶與有機質、全氮含量和細菌數量分別為正相關且極顯著(P<0.01)，而與有效磷、速效鉀含量和放線菌數量分別為正相關且顯著(P<0.05)；蛋白質酶與放線菌數量正相關且極顯著(P<0.01)，而與有機質、有效磷、速效鉀含量和細菌、真菌數量分別為正相關且顯著(P<0.05)。土壤肥力含量之間相關性表現為：有機質含量與全氮、有效磷、速效鉀含量分別為正相關且極顯著(P<0.01)，全氮含量與有效磷、速效鉀含量分別為正相關且極顯著(P<0.01)，有效磷與速效鉀含量為正相關且極顯著(P<0.01)。土壤肥力含量與土壤微生物數量相關性表現為：細菌分別與有機質、全氮、有效磷、速效鉀含量呈正相關且極顯著(P<0.01)，而放線菌含量分別與有機質、有效磷、速效鉀、細菌數量正相關且顯著(P<0.05)，真菌數量與放線菌數量正相關且顯著(P<0.05)。

表7 灰色鏈霉菌發酵液(稀釋100倍)對干旱脅迫的桔梗根際土壤微生物的影響

表8 桔梗根際土壤酶活性、土壤理化性質和土壤微生物的相關性

注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。 Note: *P<0.05, **P<0.01.

3 討 論

土壤酶活性可以作為評價土壤肥力狀況的生物指標，蔗糖酶與土壤有機質、氮、磷含量和微生物數量有關。本研究用不同濃度灰色鏈霉菌發酵液處理干旱脅迫的桔梗根際土壤，發現桔梗根際土壤的蔗糖酶、脲酶、過氧化氫酶、蛋白酶、纖維素酶活性比CK均顯著提高，尤其稀釋100倍的灰色鏈霉菌發酵液比其它濃度更為顯著(P<0.05)。由于土壤脲酶能促進土壤中氮素循環，提高土壤肥力。過氧化氫酶活性與土壤中H2O2含量密切相關，H2O2可以殺死病原菌，還能誘導一系列防御酶系統。土壤纖維素酶有助于腐殖質的形成，促進纖維素分解利用，是自然界碳循環的重要環節，最終提高土壤肥力，增加農作物的產量。土壤蛋白酶也能促進土壤中氮素循環。可見，灰色鏈霉菌發酵液隨著濃度的稀釋，土壤氮素、碳素的循環轉化速率不斷提高，腐殖質形成和有機質的轉化能力不斷增強，直到灰色鏈霉菌發酵液稀釋到100倍，土壤氮素、碳素的循環轉化速率、腐殖質形成和有機質的轉化能力達到最高值，桔梗根際土壤的蔗糖酶、過氧化氫酶、蛋白酶和纖維素酶活性均是隨著灰色鏈霉菌發酵液處理時間的延長，此4種土壤酶活性均先升高后降低；而脲酶活性在0～35 d內一直升高，并且此4種土壤酶活性均顯著高于CK。灰色鏈霉菌發酵液使干旱脅迫的桔梗根際土壤微生物群落中細菌占優勢，細菌的數量一直增加，而放線菌和真菌的數量先升高后降低。可見，施加灰色鏈霉菌有利于干旱脅迫的桔梗幼苗根際土壤酶活性的提高，間接的促進了土壤微生物的生長，增加了土壤中微生物群落的數量，能促進土壤肥力提高，說明灰色鏈霉菌能緩解桔梗幼苗受干旱脅迫。此結果與高吉坤[18]研究枯草芽抱桿菌B29有利于提高土壤中蔗糖酶、脲酶、過氧化氫酶、酸性磷酸酶活性的結果基本一致。劉慧芬[19]發現刺槐根瘤固氮菌放氮有利于增加土壤微生物，能提高脫氫酶、過氧化氨酶、脲酶、轉化酶等土壤酶活性。

本研究發現桔梗根際土壤蔗糖酶與過氧化氫酶、脲酶與纖維素酶、蛋白酶呈顯著正相關，可以促進氮素循環，說明桔梗根際土壤中這5種酶之間關系密切，它們共同影響著土壤肥力。土壤中微生物之間的關系為：細菌與放線菌、放線菌與真菌呈顯著正相關，且細菌在微生物群落中占優勢。這與何芳蘭[20]研究沙化高寒草甸土壤中細菌是土壤微生物的主要成分的結果基本一致。土壤肥力之間的關系為土壤有機質與全氮、有效磷、速效鉀互相呈極顯著正相關。土壤酶活性與土壤肥力、微生物數量的關系為脲酶與有機質、全氮、有效磷、速效鉀和細菌呈極顯著正相關，纖維素酶與有機質、全氮、有效磷、速效鉀、細菌和放線菌呈極顯著或顯著正相關，蛋白酶與有效磷、速效鉀、細菌、放線菌和真菌呈極顯著或顯著正相關，蔗糖酶和過氧化物酶與有機質、全氮、有效磷、速效鉀和細菌呈負相關且不顯著，與放線菌和真菌正相關且不顯著。從土壤酶活性、土壤肥力、微生物數量之間的相關性可以看出，土壤酶活性影響著土壤肥力和微生物數量變化，土壤肥力同時影響著土壤酶活性和微生物數量變化，它們之間是相互影響、相互制約的。這與王笛等[21-22]研究結果基本一致。

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