羅氏核酸檢測試劑在無錫血站的應(yīng)用分析

胡越，高犁，蔣瑞馨

(無錫市中心血站檢驗科，江蘇 無錫 214021)

HBV、HCV和HIV等傳染病的經(jīng)血傳播一直是影響輸血安全的關(guān)鍵因素。根據(jù)國家《獻血者健康檢查要求》的規(guī)定，血站必須對獻血者血液標(biāo)本進行乙肝表面抗原、丙肝抗體和艾滋病抗體酶免檢測。這雖然大大降低了經(jīng)血傳播疾病的風(fēng)險，但由于酶免檢測存在較長的“窗口期”，仍無法完全避免輸血傳播疾病的發(fā)生[1]。而且有部分處于乙肝隱匿性感染狀態(tài)下的獻血者獻血，這是常規(guī)酶免檢測方法無法篩查出來的[2]。近年來，具有高敏感度、高特異性的核酸擴增檢測技術(shù)（NAT）在部分發(fā)達國家的獻血者篩查中得到應(yīng)用，極大地縮短了乙肝表面抗原、丙肝抗體和艾滋病抗體檢測的“窗口期”，因酶免檢測漏檢而導(dǎo)致的輸血后病毒感染顯著減少[3]。為摸索適合本站實際情況的核酸擴增檢測方案，筆者對本站129299份酶免檢測合格的獻血者血液標(biāo)本使用美國羅氏診斷公司核酸聯(lián)合檢測試劑盒進行核酸擴增檢測，以分析羅氏MPX試劑在無錫地區(qū)獻血者篩查中應(yīng)用情況。

1 材料與方法

1．1 標(biāo)本來源 2013年4月至2016年5月本站酶免檢測合格的獻血者血液標(biāo)本129299人份。

1．2 儀器 STAR全自動加樣系統(tǒng)、FAME酶免處理系統(tǒng)、哈密爾頓全自動混樣儀、羅氏核酸提取儀、羅氏核酸擴增檢測儀、DL-5M低溫離心機。

1．3 試劑 美國羅氏診斷公司乙肝、丙肝、人類免疫缺陷病毒（1+2）NAT檢測試劑盒（Cobas Taq-Screen MPX）。北京萬泰生物藥業(yè)公司，廈門英科新創(chuàng)科技公司，北京科衛(wèi)生物科技公司乙肝、丙肝、人類免疫缺陷病毒ELISA檢測試劑盒。

1．4 方法 獻血者采血結(jié)束后留取3管血液標(biāo)本（2支用于酶免等常規(guī)檢測；1支用于核酸擴增檢測）。血液采集后按要求及時離心，4℃冰箱保存。第二日先進行酶免檢測，檢測結(jié)果為陰性的血液標(biāo)本則進行核酸擴增檢測。用哈密爾頓全自動混樣儀、羅氏核酸提取、擴增與檢測儀對血液標(biāo)本進行混樣和檢測。每6份血液標(biāo)本分別吸取167μl進行匯集后用于合并檢測核酸。每批檢測均設(shè)置一個陰性對照和三個陽性對照，每個歸集混樣管均含有內(nèi)標(biāo)對照（IC）。陰性對照不能檢測到擴增信號，而陽性對照和內(nèi)標(biāo)對照能檢測到的擴增信號應(yīng)符合試劑盒要求，否則本批實驗結(jié)果均為無效結(jié)果。若1個歸集混樣管的檢測結(jié)果為陰性，則該歸集混樣管中的6個標(biāo)本均為陰性；若1個歸集混樣管的檢測結(jié)果為陽性，則需要對該歸集混樣管中的6個標(biāo)本做單獨拆分檢測，根據(jù)單個標(biāo)本檢測結(jié)果來判定為NAT陽性或者NAT陰性。

將判定為NAT陽性的血液標(biāo)本冷凍保存，統(tǒng)一送江蘇省血液中心作確認(rèn)實驗和定量分析，對乙肝NAT陽性的血液標(biāo)本用化學(xué)發(fā)光免疫檢測系統(tǒng)做乙肝“兩對半”檢測。對酶免檢測陰性、核酸擴增檢測陽性的獻血者進行追蹤，采集血液標(biāo)本進行重復(fù)酶免檢測和核酸擴增檢測。

2 結(jié)果

對酶免檢測為陰性的129299人份血液標(biāo)本進行核酸擴增檢測，共檢測出HBV DNA陽性129例，HCV RNA陽性1例，HIV RNA陽性1例。對129例HBV DNA陽性血液進行HBV熒光定量檢測，共發(fā)現(xiàn)65例病毒拷貝數(shù)＜20IU/ml，16例病毒拷貝數(shù)＞50IU/ml，剩余48例定量試驗呈陰性。81例HBV DNA陽性標(biāo)本經(jīng)化學(xué)發(fā)光法檢測有73例為乙肝e抗體(HBeAb)和核心抗體(HBcAb)陽性。對7例HBV DNA陽性獻血者于獻血30d后采集血樣進行檢測，仍然為HBsAg陰性，HBV DNA陽性。HCV RNA陽性血液首次病毒定量為 4．27×106IU/ml，32d后本血站對該名獻血員采血復(fù)查，抗-HCV ELISA檢測為陽性，核酸檢測均有反應(yīng)性，核酸定量檢測病毒載量為 4．68×103IU/ml。 對 1例 HIV RNA陽性獻血者首次和隨訪兩次檢測結(jié)果見表1。

3 討論

核酸擴增檢測技術(shù)在我國獻血者血液篩查方面的優(yōu)勢日益明顯。研究表明隱匿性乙肝感染者與處于乙肝血清標(biāo)志物轉(zhuǎn)陽前（窗口期）的獻血者是造成乙肝表面抗原酶免檢測后仍然導(dǎo)致輸血感染乙肝的主要原因[2]，處于“窗口期”的獻血者的乙肝血清標(biāo)志物會隨時間延長而轉(zhuǎn)為陽性，而隱匿性乙肝感染者的乙肝血清標(biāo)志物一般不會轉(zhuǎn)為陽性[4]。實驗結(jié)果中81例HBV DNA陽性標(biāo)本經(jīng)化學(xué)發(fā)光法檢測有73例為乙肝e抗體(HBeAb)和核心抗體(HBcAb)陽性，判斷其為乙肝病毒攜帶者或乙肝感染恢復(fù)期。對7例HBV DNA陽性獻血者于獻血30d后采集血樣進行檢測，仍然為HBsAg陰性，HBV DNA陽性，符合隱匿型乙肝感染（OBI）的表現(xiàn)。

窗口期一般是指從人體被病毒感染到人體外周血能檢測出該病毒標(biāo)志物的這段時間，如進口酶免試劑做乙肝表面抗原、丙肝抗體和艾滋病抗體檢測的平均“窗口期”分別為 46d、71d、23d[5]，混樣核酸擴增檢測可將HBV、HCV和HIV檢測的 “窗口期”縮短到23d、58d和12d[6]。根據(jù)對HCV RNA陽性獻血者和HIV RNA陽性獻血者的追蹤檢測，證實這分別是1例處于HCV感染 “窗口期”和1例處于HIV感染“窗口期”的獻血者。盡管核酸擴增檢測只能縮短檢測感染的“窗口期”，但處在核酸檢測“窗口期”的血液傳染性極低，不少研究均表明核酸擴增檢測與酶免檢測的檢測結(jié)果有互補之效，可降低因酶免檢測漏檢而產(chǎn)生的輸血后病毒感染幾率，顯著提高輸血安全性[7-9]。根據(jù)本人的核酸檢測結(jié)果證明，美國羅氏診斷公司核酸聯(lián)合檢測試劑盒應(yīng)用于獻血者血液篩查后，能在酶免檢測陰性的血液標(biāo)本中進一步篩查出乙肝、丙肝和艾滋病核酸陽性的獻血者標(biāo)本，避免了臨床患者因輸血而感染乙肝、丙肝和艾滋病的不良事件，產(chǎn)生了良好的社會效益。

核酸擴增檢測技術(shù)可以忽略個體間的免疫應(yīng)答差異，能較早檢測出樣本中含量極低的病毒核酸成分，大大縮短檢測的“窗口期”，它與酶免檢測的原理和方法各不相同，所以將兩者結(jié)合在一起用于血液檢測，先進行酶免檢測去除陽性標(biāo)本，再進行核酸檢測，不僅降低了核酸檢測工作量，而且消除了陽性標(biāo)本易引起污染的影響因素[10]。同時核酸擴增檢測又有別于傳統(tǒng)的酶免血清學(xué)檢測，實驗操作不當(dāng)極易造成假陽性和假陰性，它對標(biāo)本處理方式、檢驗操作規(guī)程、室內(nèi)質(zhì)控、實驗室設(shè)備和布局等問題有著更為嚴(yán)格的要求，這些問題還有待進一步的探討。

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