還原型谷胱甘肽太赫茲光譜及振動模式分析

，，，，，

(山東科技大學 電子通信與物理學院，山東 青島 266590)

多肽是由氨基酸組成的簡單的蛋白質分子，谷胱甘肽是一種具有重要生理功能的活性三肽，幾乎存在于身體每一個細胞中，能幫助保持正常免疫系統的功能。谷胱甘肽由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸經肽鍵縮合而成，化學名為γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，晶體呈無色透明細長柱狀。由于谷胱甘肽本身的解毒和抗氧化能力，使得谷胱甘肽具有重要的保肝護肝作用。臨床上應用還原型谷胱甘肽作為保肝的重要藥物成分。

X射線晶體衍射是目前確定蛋白質結構最準確的方法，但要求蛋白質是晶體存在，這對于結構復雜的大分子蛋白質來說較為困難；核磁共振法是目前比較成熟的分子結構研究的方法，高分辨的核磁技術給出的結構可與X射線衍射相媲美[1]，然而其缺點是實驗耗時長，且蛋白質標記過程復雜。相比之下，太赫茲波光子能量處于大分子及分子團的振動和轉動能級，因此能夠用來探測低頻率的鍵振動、晶態聲子振動、氫鍵的伸縮和彎曲振動等[2]。太赫茲光譜對氫鍵、范德華力等許多分子間弱的相互作用力非常敏感，能夠反映化合物結構的指紋特征，因此可以用來鑒定多肽的結構[3-4]。近年來，太赫茲光譜開始被用來研究蛋白質的分子結構。Kikuchi[5]首次利用變角THz-TDS測定L-半胱氨酸和L-組氨酸的氨基酸單晶體的太赫茲光譜，發現氨基酸在THz頻段比在紅外頻段表現出更多獨特吸收特征。之后對多肽的研究也開始展開，Plusquellic等[6-7]利用THz-FTIR技術檢測不同晶型的多肽，獲得了明顯不同的THz波譜，并且發現短鏈晶型的多肽在THz波段依然有明顯的特征吸收。對于谷胱甘肽的研究，馬曉菁等[8]利用太赫茲時域光譜技術研究了還原型及氧化型谷胱甘肽在0.2～1.4 THz波段的光譜特性，得出還原型谷胱甘肽在0.8～0.9和1.2 THz處有明顯吸收峰；閆海濤等[9]利用太赫茲時域光譜測試技術，對還原型和氧化型谷胱甘肽分子在0.2～2.5 THz波段的光學特性進行了研究，測出了還原型谷胱甘肽在0.85、1.20、1.52、1.64和2.34 THz附近有明顯吸收峰，并得出樣品的平均折射率為1.77；但僅僅測出了谷胱甘肽分子的吸收峰及折射率，并沒有對各吸收峰處的分子具體振動模式給出合理的理論解釋。

本研究對三肽谷胱甘肽進行了研究，用THz-TDS對常溫下的還原型谷胱甘肽粉末進行了測量，并用Guassian09軟件采用密度泛函理論(density functional theory，DFT)對還原型谷胱甘肽的吸收譜線進行分子動力學模擬，通過實驗結果與分子模擬的比較，對各個振動吸收譜線的分子振動機制給出理論解釋，為以后的蛋白質功能結構分析提供參考。

1 振動光譜理論模擬計算

Hartree-Fock方程(簡稱HF方程)是一個應用變分法計算多電子體系波函數的方法，是量子化學中最重要的方程之一。基于分子軌道理論的所有量子化學計算方法都是以HF方程為基礎的。密度泛函理論是以電子密度為變量，將能量表示為密度的泛函，從而計算電子體系。密度泛函方法的長處在于包含了電子相關，而HF方法只是平均意義上的處理電子相關，這使得在某些體系和同等耗時的情況下，DFT計算比HF方法有更高的精度[10-11]。

Guassian09軟件是一個相當成熟的量子化學計算軟件，可以通過理論計算獲得分子在紅外的振動模式和吸收譜，用于對THz波段的吸收光譜進行解析。本研究采用Gaussian09軟件對還原型谷胱甘肽分子進行計算模擬，選取密度泛函(DFT)理論B3LYP方法，在6～31 G(d,p)基組下進行計算。首先進行分子結構優化，優化結果如圖1所示(氫原子被隱藏)，然后再進行分子的振動頻率計算。光譜模擬計算結果如圖2所示，樣品的計算結果中無虛頻出現，說明優化結果為分子能量最小的結構。由于模擬中沒有完全考慮電子相關作用以及對非簡諧效應的忽略和基組的選擇等因素，采用相應的矯正因子0.96[12-13]。

圖1 還原型谷胱甘肽分子結構優化圖Fig.1 Optimization structure of reduced glutathione molecule

2 太赫茲時域光譜測量實驗

2.1 測試樣品的制備

還原型谷胱甘肽樣品購自生工生物工程(上海)股份有限公司，純度>99.5%，使用時未進一步提純。使用FW-4A粉末壓片機在10 MPa的壓力下將還原型谷胱甘肽粉末樣品壓制成直徑13 mm、厚度1.55 mm無裂縫且兩端面平行的圓形薄片。

2.2 樣品測量的實驗條件

實驗測量采用的THz-TDS實驗裝置由Spectra-Physics公司的Mai Tai飛秒激光器(中心波長設置為780 nm，頻率為80 MHz，脈寬為100 fs)和德國BATOP公司的TDS1008太赫茲時域光譜系統(光譜范圍0.05～4.0 THz，峰值信噪比75 dB，頻譜分辨率≥2.0 GHz)組成。實驗在室溫條件下進行。

2.3 實驗測量原理光路

實驗利用太赫茲時域光譜系統(THz-TDS)采用透射式方法對樣品進行測量，整個測量系統包含四個部分，分別為飛秒激光器、太赫茲輻射產生裝置及對應的探測裝置、時間延遲系統以及數據采集與信號處理系統，其光路原理圖如圖3所示。PBS為偏振分光棱鏡，M1-M7均為反射鏡，L1、L2為聚焦透鏡。

圖3 THz-TDS透射式樣品測量原理圖Fig.3 Experimental scheme of transmission type THz-TDS

設備中所用的光電導發射天線和探測天線最大泵浦功率分別為11.8 mW和11.5 mW，而飛秒激光器的輸出功率較大，為避免損壞天線，在飛秒激光進入系統之前利用衰減片將功率降低到設備要求的130 mW以下。飛秒激光進入系統之后經過偏振分光棱鏡被分為兩束，反射光為泵浦光，透射光為探測光。泵浦光經過由步進電機和兩個反射鏡組成的光學延遲系統后，再經過反射鏡后被一個透鏡聚焦在發射天線上產生太赫茲脈沖；探測光經過一系列反射鏡和一個透鏡后被聚焦在探測天線上。時間延遲系統以及探測端經過數據采集和信號處理系統后均連接至外部計算機，用計算機直接控制和處理[14]。

2.4 測量結果

將壓制好的還原型谷胱甘肽樣品薄片放在樣品室中，經過實驗測量，從計算機中提取THz波在空氣中傳播(作為參考信號，虛線)和通過還原型谷胱甘肽測試樣品(實線)獲得的時域信號，如圖4(a)所示。將時域信號經過快速傅立葉變換得到的頻域譜圖如圖4(b)所示，可以看出，在0～2 THz范圍內還原型谷胱甘肽樣品信號相對于參考信號有明顯的吸收。

3 還原型谷胱甘肽的太赫茲光譜分析

3.1 實驗數據處理

根據文獻[15-16]提出的提取材料THz光學參數的物理模型，設入射的THz電場為ETHz(ω)，Eref(ω)和Esam(ω)分別為參考信號和樣品信號。則不經過樣品，在空氣中傳播距離L后的參考信號可以寫成

圖4 還原型谷胱甘肽的頻譜與時域譜Fig.4 Time-domain and frequency-domain spectrum of reduced glutathione

。

(1)

其中：ω為角頻率，c為光速，n0為空氣的復折射率。

當THz波垂直樣品表面入射，忽略多次反射效應，根據Fresnel公式可以得出透射率函數為

tos(ω)=2ns/(n0+ns)。

(2)

式中：ns為樣品的復折射率，n0為樣品周圍空氣的復折射率，實驗中取空氣中折射率n0為1。因而經過厚度為d的樣品的信號可以寫成

Esam(ω)=ETHz(ω)tose-jns(ωd)/ctsoe-jn0(ω)ω(L-d)/c。

(3)

根據公式(1)和(3)得到復透射函數：

H(ω)=Esam(ω)/Eref(ω)=4nse-jωd(ns-1)/c/(1+ns)2=ρ(ω)e-jφ(ω)。

(4)

其中φ(ω)和ρ(ω)分別為兩波的相位差和振幅模的比值，可由THz-TDS實驗得出。將n=n(ω)-jκ(ω)代入式(3)和(4)，當樣品的消光系數遠遠小于折射率時，有

ρ(ω)=4ns(ω)e-κ(ω)dω/c/(ns(ω)+1)2，

(5)

φ(ω)=(ns(ω)-1)ωd/c。

(6)

則樣品的折射率和吸收系數分別為：

ns(ω)=φ(ω)c/ωd+1,

(7)

αs(ω)=2κs(ω)ω/c=21n{4ns(ω)}/[ρ(ω)(ns(ω)+1)2]}/d。

(8)

3.2 結果分析

根據實驗結果，利用上述數據處理方法可得到還原型谷胱甘肽在0.1～2 THz范圍內的折射率曲線，如圖5所示。圖6為還原型谷胱甘肽在0.1～2 THz波段的吸收譜，其中虛線為根據公式(8)得出的吸收譜線，實線為Gaussian09軟件生成的模擬吸收譜線。由圖5可以看出，還原型谷胱甘肽樣品的折射率在0.1～2 THz范圍內呈整體下降趨勢，但在0.74、1.12、1.37、1.48、1.59、1.77、1.96 THz頻率位置處出現上升峰值，這與圖6中樣品的實驗測量吸收曲線的吸收峰位置(0.81、1.16、1.46、1.56、1.63、1.81、1.87 THz)基本對應，說明在特征吸收峰位置，谷胱甘肽的折射率會有明顯增大。

由圖6可以看出，還原型谷胱甘肽在0.81、1.16、1.46、1.56、1.63、1.81和1.87 THz處均有吸收峰；而理論模擬結果顯示還原型谷胱甘肽分子僅在0.43、0.78、1.11和1.83 THz處有吸收峰。并且還原型谷胱甘肽的理論吸收峰相對于實驗測量吸收峰發生了小幅頻移現象，這可能是由于理論模擬是設定在0 K條件下進行的，而實驗測量是在室溫下進行，因此會產生頻移現象[17-18]。實驗測量吸收譜在1.46～1.63 THz處的多個吸收峰，模擬結果沒有對應的吸收峰，這是由于理論模擬的是單分子狀態，而對于分子間氫鍵相互作用沒有考慮。因此，出現的吸收峰極可能是由分子間作用產生的。

圖5 還原型谷胱甘肽的折射率曲線Fig.5 Refractive index curve of reduced glutathione

圖6 還原型谷胱甘肽模擬及實驗測量吸收譜Fig.6 Simulated and experimental absorption spectrum of reduced glutathione

圖7 還原型谷胱甘肽在各吸收頻率的振動模式Fig.7 Vibration modes of reduced glutathione at each absorption frequency

進一步通過GaussianView的動態觀察來分別查看還原型谷胱甘肽分子在各個吸收峰處的振動模式，對應情況如圖7所示。還原型谷胱甘肽在0.43 THz處的吸收峰是由C21-C20扭動振動引起的(如圖7(a)所示，虛線內為主要振動位置，但未在實驗結果中顯示)。在0.81 THz處吸收峰是由于C25-C31-C34OOH、C3-C6-N12H彎曲振動引起的(如圖7(b)所示)，1.16 THz處的吸收峰是由N12H-C14扭動振動和N1H-C20-C21彎曲振動引起的(如圖7(c)所示)，1.81 THz處的吸收峰是由C14-C15扭動振動、N1H-C20扭動振動以及C21-C25-C31彎曲振動共同引起的(如圖7(d)所示)，這三個頻率實驗中均有與之對應的吸收峰值。總體而言，Gaussian軟件模擬的分子吸收譜線與實驗測量的主要吸收峰基本吻合，能夠較好地解釋實驗測量結果中出現吸收峰的微觀機制。

4 結果與討論

本研究在室溫條件下利用THz-TDS對還原型谷胱甘肽在0.1～2 THz頻率范圍的吸收譜進行了測量，研究了其折射率在0.1～2 THz頻率范圍內的變化趨勢，結果顯示其折射率呈反常色散特性，并在特征吸收峰處有小幅上升。利用Guassian09軟件對還原型谷胱甘肽在0.1～2 THz頻率范圍內分子振動模式進行了模擬，并通過GuassianView對其振動模式進行分析。在0.81、1.16、1.81 THz處實驗測得的吸收峰與理論模擬吻合較好，通過模擬結果能夠解釋其微觀形成機制，說明利用Gaussian09軟件選取DFT方法能夠較好的對實驗測量THz吸收光譜進行微觀解釋。

[1]BAX A.Two-dimensional NMR and protein structure[J].Annual Review of Biochemistry,1989,58(1):223-256.

[2]YANG D.Applications of terahertz wave technology in smart textiles[M]. Singapore：Springer,2015.

[3]SONG H J,AJITO K,SHIMIZU N,et al.Terahertz wave applications using photonic technologies[C]//General Assembly and Scientific Symposium,2011 URSI.2011:1-4.

[4]劉盛綱，鐘任斌.太赫茲科學技術及其應用的新發展[J].電子科技大學學報,2009,38(5):481-486.

LIU Shenggang,ZHONG Renbin.Recent development of terahertz science and technology and its applications[J].Journal of University of Electronic Science and Technology of China,2009,38(5):481-486.

[5]KIKUCHI N,TANNO T,WATANABE M,et al.A membrane method for terahertz spectroscopy of amino acids[J].Analytical Sciences,2009,25(3):457-459.

[6]SIEGRIST K,BUCHER C R,MANDELBAUM I,et al.High-resolution terahertz spectroscopy of crystalline trialanine:Extreme sensitivity to beta-sheet structure and cocrystallized water[J].Journal of the American Chemical Society,2006,128(17):5764-5775.

[7]AHMED Z,CHOU S G,SIEGRIST K,et al.State-resolved THz spectroscopy and dynamics of crystalline peptide-water systems[J].Faraday Discuss,2011,150(1):175-192.

[8]閆海濤，王衛寧，趙國忠，等.還原型和氧化型谷胱甘肽的THz光譜表征[C]//第十一屆全國光電技術與系統學術會議論文集.北京：電子工業出版社,2005：936-941.

[9]馬曉菁,代斌,趙紅衛，等.還原型及氧化型谷胱甘肽的太赫茲時域光譜研究[J].石河子大學學報(自然科學版),2008,26(3):347-350.

MA Xiaojing,DAI Bin,ZHAO Hongwei,et al.Terahertz time-domain spectroscopy of reduced and oxidized L-glutathione[J].Journal of Shihezi University(Natural Science),2008,26(3):347-350.

[10]劉靖疆.基礎量子化學與應用[M].北京:高等教育出版社,2004:228-289.

[11]靳濤.一價陽離子同甲醛的弱相互作用[J].山東科技大學學報(自然科學版),2013,32(1):50-55.

JIN Tao.Weak interaction of one-value ions and formaldehyde[J].Journal of Shandong University of Science and Techno-logy(Natural Science),2013,32(1):50-55.

[12]方虹霞,張琪,張慧麗，等.奧美沙坦與苯甲酸共晶的太赫茲光譜與密度泛函理論分析[J].高等學校化學學報,2015,36(12):2504-2510.

FANG Hongxia,ZHANG Qi,ZHANG Huili,et al.Terahertz spectroscopic and density functional throretical analysis of cocrystal between Olmesartan and benzoic zcid [J].Chemical Journal of Chinese Universities,2015,36(12):2504-2510.

[13]劉江燕，武書斌.化學圖文設計與分子模擬計算[M].廣州:華南理工大學出版社,2009:253-256.

[14]李德華,白亞,周薇,等.利用飛秒激光脈沖整形進行太赫茲波整形[J].山東科技大學學報(自然科學版),2008,27(4):60-64.

LI Dehua,BAI Ya,ZHOU Wei,et al.THz wave shaping technology via the femtosecond laser pulse shaping[J].Journal of Shandong University of Science and Technology(Natural Science),2008,27(4):60-64.

[15]TIMOTHY D D,RICHARD G B,DANIEL M M.Material parameter estimation with terahertz time-domain spectroscopy[J].Journal of the Optical Society of America A:Optics,Image Science and Vision,2001,18(7):1562-1571.

[16]DUVILLARET L,GARET F,COUTAZ J L.Highly precise determination of optical constants and sample thickness in terahertz time-domain spectroscopy[J].Applied Optics,1999,38(2):409-415.

[17]KING M D,BUCHANAN W D,KORTER T M.Identification and quantification of polymorphism in the pharmaceutical compound diclofenac acid by terahertz spectroscopy and solid-state density functional theory[J].Analytical Chemistry,2011,83(10):3786-3792.

[18]HAKEY P M,ALLIS D G,OUELLETTE W.Cryogenic terahertz spectrum of (+)-methamphetamine hydrochloride and assignment using solid-state density functional theory[J].Journal of Physical Chemistry A,2009,113(17):5119-5127.