賁門癌中長鏈非編碼RNA和微小RNA差異表達譜及相關性分析

楊俊強，胡曉辰，齊義軍，高社干

河南科技大學醫學院臨床醫學院；河南科技大學第一附屬醫院腫瘤醫院；河南省腫瘤表觀遺傳重點實驗室 河南洛陽 471003

賁門癌是指發生在胃賁門部、食管胃交界線下約2 cm范圍內的腺癌，是一種特殊類型的胃癌，其獨特的診療方式有別于其他解剖部位起源的胃癌。無論是在我國還是全球范圍內，賁門癌的死亡率和發病率在各類惡性腫瘤中均位居前列[1-2]。隨著長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)研究深入，越來越多的研究[3-4]表明lncRNA和miRNA作為兩種重要的非編碼RNA在多種生物學過程中發揮著重要的調控作用，并與多種腫瘤發生和預后相關。本研究利用基因芯片鑒定15例賁門癌與癌旁組織中lncRNA和miRNA差異表達譜，應用生物信息預測和qRT-PCR驗證H19和hsa-miR-148a-3p表達的相關性。

1 材料與方法

1.1標本收集收集2011年2月至2013年1月在河南科技大學第一附屬醫院接受治療的52例賁門癌患者的手術癌和癌旁組織標本，其中15例標本用于基因芯片檢測，37例標本用于后續PCR驗證?；颊吣挲g37～82歲，男40例，女12例。所有患者均接受賁門癌根治術手術治療，術前均未接受放化療。腫瘤解剖學部位均位于食管胃交界線下2 cm范圍內，且經組織學證實為腺癌。

1.2總RNA提取和質控用美國Invitrogen公司的Trizol試劑盒和德國Qiagen公司的miRNeasy mini試劑盒從15對賁門癌及癌旁組織中提取總RNA，NanoDrop ND-1000(NanoDrop, Wilmington, DE)測定260 nm/280 nm吸光度比值范圍1.8～2.0。

1.3基因芯片檢測和數據分析美國Agilent公司的Arraystar Human LncRNA microarray V2.0芯片包含33 045條lncRNA；miRCURY LNATMmicroRNA Array，7th gen-hsa, mmu&rno芯片包含人鼠兩個物種共3 100條。用美國英杰公司的SuperScript ds-cDNA synthesis 合成雙鏈cDNA；RNA標記采用美國Agilent公司的Quick Amp Labeling Kit和德國QIAGEN 公司的miRCURYTMHy3TM/Hy5TMPower Labeling kit；芯片雜交應用美國NimbleGen公司提供的試劑盒完成。

應用GenePix Pro 6.0軟件中的Axon GenePix 4000B掃描并保存基因芯片信息為JPEG圖片，導入NimbleScan V2.5軟件進行相關數據分析。將基因探針數據和RNA表達數據導入Agilent GeneSpring GX V11.5.1軟件中，通過Quantile方法進行數據的標準化，從而得到lncRNA和miRNA的表達譜。

選取lncRNA差異性表達倍數大于5倍的lncRNA分子，并查詢lncRNA數據庫(RefSeq_NR、Ensembl和UCSC_knowngene)，具有明確基因注釋的lncRNA為本實驗確定的差異表達的lncRNA。選取miRNA差異性表達倍數大于2倍為本實驗確定的差異表達的miRNA。

1.4MiRNA的生物信息預測和篩選用瑞典哥德堡大學miRcode預測與lncRNA上miRNA應答元件(microRNA response elements，MRE)位點結合的miRNA。miRcode軟件是利用lncRNA上的MRE來預測miRNA(www.miRcode.org)。同時利用中山大學開發的Starbase V2.0預測miRNA，以提高預測的準確性。Starbase V2.0通過高通量測序結果來預測miRNA(http://starbase.sysu.edu.cn/)。并篩選出兩個軟件共同預測的miRNA。

1.5qRT-PCR驗證用qRT-PCR驗證lncRNA H19和miRNA hsa-miR-148a-3p相關性。lncRNA反應體系(20 μL)包括Primer 1/2各0.5 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 7 μL；miRNA反應體系(20 μL)含2×All-in-One qPCR Mix 10 μL、All-in-OneTMmiRNA qPCR Primer 2 μL、Universal Adaptor PCR Primer 2 μL、cDNA 2 μL、ROX Reference Dye 0.1 μL、ddH2O 6 μL。

1.6統計學處理采用Graphpad Prism 5和SPSS 19.0進行分析，應用配對資料的t檢驗或秩和檢驗比較賁門癌與癌旁組織中lncRNA和miRNA表達水平的差異；lncRNA H19和miRNA表達的相關性采用Pearson相關分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1賁門癌與癌旁組織中RNA表達譜利用基因芯片檢測15對賁門癌與癌旁組織中5倍或2倍以上差異性表達的lncRNA、miRNA表達譜，共鑒定182個差異表達lncRNA(高表達和低表達分別為166個和16個)和152個差異表達miRNA(高表達和低表達分別為46個和106個)。

2.2lncRNAH19靶點miRNAs的預測通過比對lncRNA表達譜中15例癌與癌旁組織的差異性表達倍數、標準化強度值、查詢lncRNA相關的數據庫，從166個高表達lncRNA選擇H19進行深入分析。H19在賁門癌中的表達是癌旁組織的9.74倍(P<0.001)。賁門癌組織中H19的標準化強度值明顯高于癌旁組織[(14.71±0.476)>(11.426±2.121)，t=5.851,P<0.001]。經miRcode和Starbase V2.0分析，H19相關的miRNA個數分別為69和39，其中7個為重復，分別是hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-18b-5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-454-3p和hsa-miR-93-5p(表1)。

2.3賁門癌組織中H19和hsa-miR-148a-3p表達的qRT-PCR檢測及相關性分析37對賁門癌組織中，賁門癌組織中H19表達高于相應的癌旁組織 [2.49(0.84～4.68)>0.89(0.50～2.07),Z=2.351,P=0.019]，而hsa-miR-148a-3p在癌組織中的表達量低于癌旁組織 [1.10(0.73～1.76)<2.83(0.99～5.35),Z=3.551,P<0.001]。相關性分析表明，在賁門癌中H19與hsa-miR-148a-3p的表達呈負相關(r=-0.398，P<0.001)。

表1 賁門癌與癌旁組織表達譜中H19及相關聯的miRNA

3 討論

近年來，lncRNA和miRNA分子已經成為腫瘤領域的研究熱點[5-6]。越來越多的研究[7-8]表明lncRNA和miRNA參與了細胞生長、增殖、分化、凋亡等多個生理過程。本研究利用基因芯片鑒定了15對賁門癌與癌旁組織lncRNA和miRNA差異表達譜。從差異表達倍數5倍以上lncRNA選取 H19，并通過軟件預測和篩選后，共發現H19與7條miRNA可能存在相關性。經qRT-PCR定量分析，H19和hsa-miR-148a-3p在賁門癌組織中表達存在明顯相關性，與芯片結果和生物信息預測結果一致，表明H19可能直接調控hsa-miR-148a-3p表達，導致hsa-miR-148a-3p降解、表達水平降低。

目前已有多項研究[9]表明H19在多種腫瘤細胞中呈現過表達，并與腫瘤的發生發展有著密切聯系。一項薈萃研究[10]分析了肺癌、胃癌、肝癌、膽囊癌等4種不同類型腫瘤與H19表達有關，結果顯示4種腫瘤中H19過表達與較差生存期呈正相關。在另一項薈萃研究[11]中，作者分析了多個研究中多種腫瘤患者的臨床資料與H19表達量的相關性，發現H19過表達與淋巴結轉移及遠處轉移呈正相關。在TGF-β誘導上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)發生過程中，H19和miR-675表達量增高，并伴隨EMT相關分子的改變，該過程涉及磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B通路激活，H19和Slug表達升高，進而使E-cadherin表達降低[12]。在結直腸癌中，H19還可以通過調控周期蛋白依賴性激酶4和細胞周期蛋白D1的表達誘導成視網膜細胞瘤蛋白的磷酸化[13]。此外，還有研究發現H19能夠與多種miRNA相互作用，參與腫瘤發生發展過程，如：miR-675、miR-200家族、miR-let7家族等[14-16]。在喉癌中，小干擾RNA抑制H19表達可下調has-miR-148a-3p的表達[17]。在最新的研究[18]報道中，lncRNA可以作為一種競爭性內源RNA，通過MRE以“海綿”吸附的方式與miRNA相互結合，從而降低了機體內miRNA的表達。

總之，本研究鑒定賁門癌與癌旁組織中差異性表達的lncRNA和miRNA分子，其中H19和has-miR-148a-3p在賁門中的表達呈負相關。該研究結果不僅豐富了賁門癌變機制，為進一步鑒定賁門癌分子標志物和精準醫療分子靶點奠定了基礎，并有助于賁門癌癥早期診斷、高危人群篩查、個體化精準治療以及防治癌前病變等。在賁門癌中，H19與has-miR-148a-3p表達的準確分子機制，尚需進一步研究證實。

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