不同壓力灌注下上尿路梗阻大鼠的腎損傷程度

黃 倩,柳懿鵬

武漢市第一醫院泌尿外科 武漢 430022

經皮腎鏡碎石術、輸尿管鏡碎石術等微創手術已經成為治療上尿路結石的主要手術方法，其創傷小,并發癥少,患者術后恢復快[1]。這些手術過程中均需要沖水以保持視野清晰并幫助排出碎石。有研究[2]報道當腎盂壓力超過30 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)時會導致腎盂靜脈以及淋巴管反流，而經皮腎鏡取石術腎盂灌注壓力常常大于350 mmHg，如此高的灌注壓力可能會導致腎功能損害[3]。很多結石患者術前已經合并有不同程度的上尿路梗阻，可能已經存在腎功能受損[4]。梗阻的腎臟可能會對術中操作過程中的灌注壓力更敏感。因此，我們通過構建大鼠模型，觀察上尿路梗阻程度是否影響腎臟對灌注壓力的耐受能力。

1 材料與方法

1.1動物與分組從華中科技大學同濟醫學院動物實驗中心購買80只7周齡雄性SD大鼠(生產批號：2016SD109)，體重180 g左右。按照實驗室標準方法飼養1周。預實驗結果顯示正常大鼠灌注壓力達100 mmHg時可發生腎組織損傷。隨機將動物分成8組，每組10只。其中4組(M0～M3組)進行造模形成輕度上尿路梗阻，然后分別給予0、20、60、100 mmHg壓力的腎盂灌注。剩余4組(S0～S3)進行造模形成重度上尿路梗阻，然后分別給予0、20、60、100 mmHg壓力的灌注。

1.2手術操作方法大鼠禁飲食8 h，稱重后，按30 mg/kg腹腔內注射戊巴比妥麻醉。通過腹部正中切口暴露左側輸尿管、腰大肌。分離腰大肌，將輸尿管包埋在腰大肌內約1 cm長(輕度組)或3 cm長(重度組)[4]，然后關閉腹腔。2周后，用超聲波檢查腎盂積水情況，記錄腎盂擴張程度和腎實質厚度。然后再次手術，暴露積水的腎盂，將0.7G頭皮針插入腎盂并連接壓力記錄儀(Biopac，CA)以記錄腎盂內壓力，再將另一個0.7G頭皮針插入腎盂并連接壓力泵，用37 ℃生理鹽水按相應壓力進行灌注。灌注8 min后停止2 min，重復操作4次。然后將包埋入腰大肌的一段輸尿管松解出來，關閉腹腔。

1.3取材術后48 h處死大鼠，收集左腎，橫向切分腎組織，然后用福爾馬林固定，石蠟包埋，5 μm厚切片。

1.4觀察指標

1.4.1 細胞凋亡檢測 使用原位細胞凋亡檢測試劑盒(瑞士Roche Applied Science公司)檢測，按試劑盒說明書操作，計算凋亡細胞百分比，即為凋亡指數[5]。

1.4.2 腎損傷分子1(kidney injury molecule 1,KIM-1)和富半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich protein 61,Cyr61)檢測 石蠟切片經二甲苯脫蠟，水化，微波抗原修復及抑制內源性酶后，加一抗NGAL(加拿大Santa Cruz Biotechnology公司)于4 ℃潮濕恒溫箱中孵育過夜；然后將生物素化的二抗、辣根過氧化物酶及3,30-二氨基聯苯等按照說明書加入；蘇木精復染，鹽酸乙醇純化，乙醇脫水，二甲苯清洗，然后裝入凝膠。于光鏡(100倍)下觀察。每個視野選擇5個區域，每個區域觀察100個腎小管上皮細胞，計算陽性細胞(染成棕色的細胞)百分比并進行評分：沒有陽性細胞評為0分，陽性細胞百分比≤20%為1分， >20%且≤50%為2分，>50%且≤75%為3分，>75%為4分[6]。

1.5數據處理使用SPSS 13.0進行數據處理。輕度和重度梗阻大鼠腎盂擴張程度和腎實質厚度的比較采用兩獨立樣本t檢驗，對腎小管上皮細胞凋亡指數、KIM-1和Cyr61表達評分進行2×4析因設計的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1造模情況輸尿管包埋2周后，用超聲波檢查腎盂積水情況。輕度、重度梗阻組腎盂擴張程度分別為(0.27±0.05) cm和(0.51±0.07) cm，腎實質厚度分別為(0.27±0.04) cm和(0.20±0.03) cm，兩組比較差異均有統計學意義(t=9.258，P=0.006；t=3.756，P=0.005)，說明造模結果符合實驗要求。

2.2腎小管上皮細胞凋亡指數見圖1、表1。可以看出梗阻程度越重，灌注壓力越高，腎小管上皮細胞凋亡指數越高；提示梗阻越重，越可能在較低的灌注壓力下出現高的凋亡指數。

1～4：灌注壓分別為0、20、60、100 mmHg；A：輕度梗阻；B：重度梗阻圖1 8組腎組織腎小管上皮細胞凋亡情況(×100)

梗阻程度灌注壓0mmHg20mmHg60mmHg100mmHg輕度0．211±0．0520．226±0．0580．239±0．0640．623±0．116重度0．329±0．0910．313±0．1050．653±0．0870．676±0．118

F梗阻程度=69.528，F灌注壓=81.051，F交互=16.479，P均<0.001

2.3腎小管上皮細胞中KIM-1和Cyr61的表達見圖2、3和表2、3。梗阻程度越重，灌注壓力越高，KIM-1和Cyr61的表達越高；提示梗阻越重，越可能在較低的灌注壓力下出現高的KIM-1和Cyr61表達。

1～4：灌注壓分別為0、20、60、100 mmHg；A：輕度梗阻；B：重度梗阻圖2 各組腎組織腎小管上皮細胞KIM-1的表達情況(SP，×100)

1～4：灌注壓分別為0、20、60、100 mmHg；A：輕度梗阻；B：重度梗阻圖3 各組腎組織腎小管上皮細胞Cyr61的表達情況(SP，×100)

梗阻程度灌注壓0mmHg20mmHg60mmHg100mmHg輕度1．209±0．5261．334±0．6791．356±0．7133．652±0．839重度1．482±0．2731．521±0．3063．792±0．6273．926±0．711

F梗阻程度=33.143，F灌注壓=69.521，F交互=15.699，P均<0.001

表3 腎小管上皮細胞Cyr61的表達(n=10)

F梗阻程度=52.901，F灌注壓=110.146，F交互=28.233，P均<0.001

3 討論

腎盂高灌注壓力對腎臟造成的損傷受到越來越多的重視。研究[2，7-8]證實，當腎盂灌注壓力超過30 mmHg持續10 min可導致腎盂淋巴、靜脈的逆流，嚴重的逆流可導致體溫過低、膿毒血癥、心血管疾病、腎損傷的發生。在本研究中，我們觀察到，上尿路梗阻程度越嚴重，導致大鼠腎臟損傷的灌注壓力閾值越低。這表明，嚴重梗阻的腎臟對腎盂灌注壓力的耐受能力下降，更容易在輸尿管鏡、經皮腎鏡等手術操作過程中發生急性腎損傷。

腎小管上皮細胞在鹽和水重吸收、代謝產物的排泄方面具有重要作用，其受損將導致腎功能下降[8]。KIM-1是一種跨膜蛋白，在正常腎臟不表達，在腎損傷時表達于腎小管上皮細胞，是常用的腎小管損傷生物標志[9]。Cyr61在所有類型的血管內皮細胞中均有表達，其作用是調節增殖、遷移以及血管內皮和成纖維細胞的黏附。Cyr61對傷口愈合、組織重構具有促進作用[10]。KIM-1及Cyr61表達升高提示腎組織缺血受損。

本實驗旨在模擬結石導致的不同程度的上尿路梗阻患者在進行經皮腎鏡或輸尿管鏡手術治療過程中，腎盂受到各種壓力灌注時出現的腎損傷情況。初期的獨立腎臟模型實驗中，灌注后動物模型容易發生死亡；此外在臨床實際中，孤立腎并腎結石患者相對較少。因此本實驗中大鼠兩個腎臟僅一個被造成上尿路梗阻模型并進行灌注實驗，而另一個腎臟未被切除。但這種造模方法不能利用血清肌酐水平衡量腎功能受損情況，因此我們使用KIM-1和Cyr61來評價腎小管上皮細胞的損傷程度[11]。雖然動物模型仍存在一定的局限性，大鼠腎臟與人類腎臟對腎盂灌注的耐受力不一樣[12]，但是實驗結果提示，當上尿路梗阻存在時，腎盂灌注更容易造成急性腎損傷，梗阻程度越重，對于腎盂灌注壓力的耐受越差。今后可在臨床上進行相關研究，同時針對不同程度腎積水探索最佳腎盂灌注壓力區間，以減輕手術中急性腎損傷，同時保持良好的視野，實現更快、更徹底、更安全的碎石。

[1] AYDIN M,HAKAN N,DEVECI U,et al.Comment on the paper entitled 'Erythropoietin ameliorates oxidative stress and tissue injury following renal ischemia/reperfusion in rat kidney and lung'[J].Med Princ Pract,2014,23(5):485

[2] 曾鵬,蔣重和,莫鑒鋒,等.新型標準腎鏡聯合EMS第四代碎石清石系統經皮腎鏡取石術中腎盂內壓變化[J].現代泌尿外科雜志,2016,21(10):768

[3] ZHANG S,ZHANG Q,JI C,et al.Improved split renal function after percutaneous nephrostomy in young adults with severe hydronephrosis due to ureteropelvic junction obstruction[J].J Urol,2015,193(1):191

[4] 趙偉,趙永哲,王君,等.輸尿管硬鏡聯合輸尿管軟鏡治療嵌頓性輸尿管上段結石126例臨床效果評價[J].實用臨床醫藥雜志,2016,20(7):140

[5] CHRISTENSEN ME,JANSEN ES,SANCHEZ W,et al.Flow cytometry based assays for the measurement of apoptosis-associated mitochondrial membrane depolarisation and cytochrome c release[J].Methods,2013,61(2):138

[6] 曹全富,王洛夫,蘭衛華,等.C-反應蛋白檢測在上尿路結石合并腎臟化膿性感染診治中的應用價值[J].檢驗醫學與臨床,2016,13(21):3091

[7] 劉剛,唐瑭,譚凡,等.腎靜態顯像診斷上尿路感染的臨床研究[J].現代生物醫學進展,2016,16(6):1124

[8] 史紅雷,郭宏騫,李笑弓,等.腎結石患者行MPCNL中腎盂內壓的測定及其臨床意義[J].江蘇醫藥,2007,33(6):612

[9] 鄧飛,許文德,姚子明,等.經皮腎鏡取石術在老年復雜性腎結石中的應用[J].中國老年學雜志,2016,36(19):4832

[10]JANSSEN C,JGER W,MOSKALEV I,et al.Erythropoietin accelerates the regeneration of ureteral function in a murine model of obstructive uropathy[J].J Urol,2015,193(2):714

[11]柳懿鵬,曹智修.腎衰合劑對大鼠腎盂高灌注壓損傷的保護作用[J].中成藥,2017,39(3):608

[12]SALERNO A,NAPPO SG,MATARAZZO E,et al.Treatment of pediatric renal stones in a Western country: a changing pattern[J].J Pediatr Surg,2013,48(4):835