大蒜素對慢性腎衰大鼠氧化應激和炎癥反應的影響

楊雅楠

0 引言

慢性腎功能衰竭(Chronic renal failure，CRF)是各種腎臟疾病終末期的共同表現，病程不可逆且進行性加重[1]，目前尚無法治愈，臨床上主要采取透析、降脂、抗聚、抗凝等治療措施以緩解CRF癥狀并延緩病情發展[2-3]，因此，CRF一直是醫藥研究者關注的熱點與難點。既往Locatelli等[4]和楊婧等[5]研究發現，氧化應激損傷和炎癥反應是慢性腎病發生發展的重要因素，并且與患者預后密切相關。大蒜素是一種具有抗氧化、抗凋亡等多種藥理學作用的二烯丙基三硫化物，但其對CRF大鼠氧化應激損傷和炎癥反應是否具有抑制作用尚未見文獻報道。本研究通過制備CRF大鼠模型并給予大蒜素進行干預治療，探討大蒜素對CRF大鼠氧化應激損傷和炎癥反應的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥物與試劑 SD大鼠，清潔級，雄性，180～220 g，河北省實驗動物中心提供[SCXK(冀)：2013-1-003]。大蒜素注射液(黑龍江江世藥業有限公司，規格：2 mL∶30 mg)；H&E試劑盒和SOD、CAT、MDA、T-AOC、AOPPs、CRP、IL-1、IL-6、TNF-α、sICAM-1、VCAM-1試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司)；BUN、SCr、UA試劑盒(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)；腺嘌呤(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 動物分組、模型制備與給藥 100只實驗用大鼠，隨機分為正常對照組、模型對照組、大蒜素(5、10、20 mg/kg)組，每組20只。參照杜卉蓮等[8]研究報道的實驗方法制備CRF大鼠模型：25%腺嘌呤溶液250 mg/(kg·d)，連續灌胃21 d，制備CRF大鼠模型，正常對照組給予正常飲食、水。造模完成后，大蒜素5、10、20 mg/(kg·d)組腹腔注射治療，正常對照組與模型對照組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液，療程為28 d。

1.3 檢測指標 ①收集24 h尿量，通過生化分析儀測定24 h尿蛋白量。②血清腎功能指標檢測：腹主動脈取血(不抗凝)，離心取血清，通過生化分析儀測定血清BUN、SCr、UA含量。③腎臟指數的計算：實施麻醉后取腎臟，稱量左側腎臟重量，腎臟指數=左側腎臟重量/體重。④腎臟組織病變的觀察：取稱量后左側腎臟置于4%多聚甲醛溶液固定72 h，然后行石蠟包埋、切片、展片和脫蠟水化處理，行常規H&E染色后，通過倒置光學顯微鏡觀察腎臟組織形態結構變化。⑤腎臟組織抗氧化酶活性和MDA含量測定：取右側腎臟、加入適量冷裂解液行研磨勻漿，離心(3 000 r/min，10 min)取上清液，按試劑盒說明，通過化學比色法測定腎臟組織SOD、CAT活性和MDA含量。⑥血清中T-AOC和AOPPs水平的測定：腹主動脈取血(不做抗凝處理)，離心(1 500 r/min，10 min)取血清，采用化學比色法測定血清中T-AOC和AOPPs水平。⑦血清中炎癥因子含量測定：參照各指標ELISA檢測試劑盒操作說明，通過酶標儀檢測血清中AOPPs、CRP、IL-1、IL-6、TNF-α、sICAM-1、VCAM-1含量水平。

2 結果

2.1 大蒜素對CRF大鼠24 h尿量、24 h尿蛋白量的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠24 h尿量顯著增加、24 h尿蛋白量顯著升高(P<0.01)。經大蒜素10、20 mg/(kg·d)治療28 d后，CRF大鼠24 h尿量和24 h尿蛋白量顯著降低(P<0.05或P<0.01)。結果見表1。

2.2 大蒜素對CRF大鼠體重、腎臟指數的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠體重和腎臟指數均升高(P<0.01)；經大蒜素10、20 mg/(kg·d)治療28 d后，大鼠體重升高(P<0.05)，腎臟指數降低(P<0.01)。見表1。

2.3 大蒜素對CRF大鼠血清腎功能指標的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清腎功能監測指標(BUN、SCr、UA含量)升高(P<0.01)；經大蒜素10、20 mg/(kg·d)治療28 d，上述指標降低(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表1 各組大鼠24 h尿量、24 h尿蛋白量、體重、腎臟指數比較

注：與正常對照組比較，**P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.4 大蒜素對CRF大鼠腎臟組織病變的影響 觀察各組大鼠腎臟HE染色病理切片：正常對照組大鼠腎小球、腎小管及間質區組織結構和細胞形態均未見異常；模型對照組呈現腎小球變性、數量減少、球囊黏連、囊腔和管腔擴大，腎小管內結晶、壞死處可見大量炎癥細胞和少量中性粒細胞浸潤；與模型對照組比較，經大蒜素5、10、20 mg/(kg·d)治療28 d，CRF大鼠腎臟組織病變明顯改善，以20 mg/(kg·d)組最為顯著。見圖1。

2.5 大蒜素對CRF大鼠腎臟組織抗氧化酶活性和MDA含量的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠抗氧化酶活性顯著降低，MDA含量顯著升高(P<0.01)；經大蒜素10、20 mg/(kg·d)治療28 d，CRF大鼠SOD活性升高，降低MDA含量(P<0.05或P<0.01)，經20 mg/(kg·d)治療,能夠升高CAT活性(P<0.01)。結果見表3。

2.6 大蒜素對CRF大鼠血清T-AOC、AOPPs水平的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清T-AOC水平降低(P<0.01)，AOPPs水平升高(P<0.01)；經大蒜素10、20 mg/(kg·d)治療28 d,CRF大鼠AOPPs水平降低(P<0.05或P<0.01)；經大蒜素20 mg/(kg·d)治療,T-AOC水平升高(P<0.05)。結果見表4。

表2 各組大鼠血清腎功能監測指標

注：與正常對照組比較，**P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖1 各組大鼠腎臟組織病變(HE，400×)

組別只數SOD(U/mgprot)CAT(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)正常對照組2013.1±1.82.5±0.64.6±1.1模型對照組206.4±1.0**1.2±0.4**15.2±2.3**大蒜素5mg/(kg·d)組207.1±1.31.5±0.313.0±2.7大蒜素10mg/(kg·d)組208.9±1.5#1.6±0.48.1±1.6##大蒜素20mg/(kg·d)組2011.2±1.6##1.9±0.6##6.3±1.2##

注：與正常對照組比較，**P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.05，##P<0.01

表4 各組大鼠血清T-AOC、AOPPs水平比較

注：與正常對照組比較，**P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.7 大蒜素對CRF大鼠血清sICAM-1、VCAM-1含量的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清sICAM-1、VCAM-1含量升高(P<0.01)；經大蒜素10、20 mg/(kg·d)治療28 d，CRF大鼠血清sICAM-1、VCAM-1含量顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見表5。

表5 各組大鼠血清sICAM-1、VCAM-1含量比較

注：與正常對照組比較，**P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.8 大蒜素對CRF大鼠血清CRP、IL-1、IL-6、TNF-α含量的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清hs-CRP、IL-1、IL-6、TNF-α含量升高(P<0.01)；經大蒜素10、20 mg/(kg·d)治療28 d，CRF大鼠血清CRP、TNF-α含量降低(P<0.05或P<0.01)；經大蒜素20 mg/(kg·d)治療，CRF大鼠血清IL-1、IL-6含量降低(P<0.05或P<0.01)。見表6。

3 討論

在已知CRF發生發展的病理機制中，氧化應激和炎癥反應發揮著關鍵作用[6-8]，這也為新型抗CRF藥物的研究提供了新的思路。大蒜素是一種具有多種生物學活性的二烯丙基三硫化物[4-5]，本實驗研究發現，經大蒜素治療28 d，能夠有效減少CRF大鼠排尿量，降低24 h尿蛋白量，降低血清BUN、SCr、UA含量，抑制CRF大鼠腎臟組織病變，降低腎臟指數，提示大蒜素對CRF大鼠腎臟具有一定的保護作用。

既往Locatelli等[4]研究發現，氧化應激損傷與慢性腎病發生發展及患者預后密切相關。機體組織抗氧化酶活性降低是導致氧自由基(ROS)過剩的主要原因，腎臟組織SOD、CAT含量豐富，是清除ROS而抑制氧化應激損傷的重要屏障[9]。韓海燕等[10]研究顯示，抗氧化酶活性降低將導致ROS蓄積而引發脂質過氧化損傷，MDA含量升高。T-AOC水平能夠反映機體整體抗氧化能力；AOPPs是一種氧化修飾蛋白，為常用體內氧化應激標志物[11]。Li等[12]報道，持續靜脈注射AOPPs，能夠加重慢性腎病動物氧化應激損傷，此外，既往研究發現，AOPPs能夠介導機體炎癥反應[13]。本研究發現，經大蒜素治療28 d，能夠有效改善CRF大鼠腎臟組織抗氧化酶(SOD、CAT)活性并降低MDA含量，提高血清T-AOC水平并降低AOPPs水平，提示大蒜素具有抑制CRF大鼠氧化應激損傷的作用。

血清炎癥細胞因子(CRP、IL-1、IL-6、TNF-α)含量水平是臨床監測機體炎癥反應的常用指標，而sICAM-1、VCAM-1含量與炎性細胞浸潤密切相關[14]。本研究發現，經大蒜素治療28 d，能夠有效降低CRF大鼠血清CRP、IL-1、IL-6、TNF-α、sICAM-1、VCAM-1含量水平，進而起到抑制炎癥反應的作用。

綜上所述，大蒜素能夠有效改善CRF大鼠腎功能，抑制腎臟組織病變，改善抗氧化酶活性、降低氧化應激損傷，調節炎癥因子水平、抑制炎癥反應，提示大蒜素可能通過降低氧化應激損傷和抑制炎癥反應，對CRF大鼠起到一定的保護作用。

表6 各組大鼠血清CRP、IL-1、IL-6、TNF-α含量比較

注：與正常對照組比較，**P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.05，##P<0.01

[1] 吳鑫洪,丁國明,韓穎敏.腎衰寧聯合包醛氧淀粉治療慢性腎功能衰竭的臨床療效觀察[J].求醫問藥,2011,9(9):260-261.

[2] 馮青,萬毅剛,蔣春明,等.中藥延緩腎功能衰竭進展的機制和效果[J].中國中藥雜志,2011,36(9):1122-1128.

[3] 王磊.血液透析治療慢性腎功能衰竭的臨床療效觀察[J].中國實用醫藥,2011,6(25):52-53.

[4] Locatelli F,Canaud B,Eckardt KU,et al.Oxidative stress in end-stage renal disease:an emerging threat to patient outcome[J].Nephrol Dial Transplant,2003,18:1272-1278.

[5] 楊婧,嚴睿俊,王琛,等.腎衰II號方對慢性腎臟病患者腎功能及炎癥因子的影響[J].中國中醫藥信息雜志,2014,21(12):15-18.

[6] 王明娟,耿永芝,劉景華,等.白藜蘆醇對抗酒精誘導的SH-SY5Y細胞損傷作用:氧化應激與凋亡[J].世界華人消化雜志,2014,22(36):5594-5601.

[7] 張宏睿,林永廉.大蒜素對糖尿病大鼠CRP、TNF-α、PAI-1及IL-6的影響[J].遼寧中醫藥大學學報,2008,10(2):34-35.

[8] 杜卉蓮,傅曉晴.慢性腎衰動物的模型制備及臨床應用[J].中醫研究,2005,18(12):53-57.

[9] Lartigue A,Burlat B,Coutard B,et al.The megavirus chilensis Cu,Zn-superoxide dismutase:the first viral structure of a typical CCS-independent hyperstable dimeric enzyme[J].J Virol,2014,2588(14):254-261.

[10]韓海燕,路建饒,王新華,等.腎衰方對5/6腎切除大鼠的氧化應激和微炎癥的作用與機制[J].時珍國醫國藥,2015,26(10):2391-2394.

[11]文志勇,毛萍,金召英,等.復方黃甘提取物對慢性腎衰大鼠氧化應激的影響[J].中藥材,2012,35(6):957-961.

[12]Li HY,Hou FF,Zhang X,et al.Advanced oxidation protein products accelerate fibrosis in a remnant kidney model[J].J Am Soc Nephrol,2007,18(2):5232-5238.

[13]Witko-Sarat V,Friedlander M,Nguyen-Khoa T,et al.Advanced oxidation protein products as novel mediators of inflammation and monocyte activation in chronic renal failure[J].J Immunol,1998,161(5):2524-2532.

[14]王興紅,常陸林,王麗菲.槲皮素對糖尿病大鼠腎臟氧化應激和血清炎癥相關因子的影響[J].中藥藥理與臨床,2014,30(4):39-42.