烏司他丁對糖尿病膿毒癥大鼠急性腎損傷的保護作用

曹玥，陳虎，陳凱，陳暢，張宗澤

（武漢大學中南醫院麻醉科，湖北武漢 430071）

糖尿病患者每年都需要花費大量的醫療資源，而據報道，至2035年，全球范圍內糖尿病的患病人數將從現在的3.82億增長至5.92億［1］。糖尿病患者患病后各種并發癥眾多，以感染為最。糖尿病患者外科手術后感染易導致膿毒癥的發生，膿毒癥是急性腎損傷（AKI）的首要病因，也是危重患者死亡的重要原因之一［2］。因此，如何改善糖尿病患者術后嚴重感染所致AKI，從而降低糖尿病患者術后病死率對臨床工作有重要意義。

烏司他丁（UTI）是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，能夠抑制多種蛋白酶、脂水解酶、糖水解酶和不良刺激引起的炎性因子的釋放［3-4］。但是，UTI對于糖尿病患者合并膿毒癥時的腎臟保護作用未見報道，作用機制不明。因此，本研究擬觀察UTI對2型糖尿病膿毒癥大鼠AKI的保護作用，同時探討其對全身炎性反應，氧化應激反應和腎臟局部缺氧反應的影響，為今后糖尿病合并膿毒癥患者的治療提供重要的理論依據?，F將其實驗結果及臨床意義報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物選取與分組 SPF級同批健康雄性SD大鼠60只，體質量180～220 g，購于武漢大學動物實驗中心。造模前2周常規喂養，前一晚禁食不禁飲。隨機選取10只喂以普通飼料，作為空白對照組（C組）。剩余50只喂以高脂飼料，動物飼料主要參照張新杰等［5］使用的方法自行配制。喂養5周后，高脂組按30 mg·kg－1體質量腹腔單次注射鏈脲佐菌素（STZ），注射3 d后，以隨機血糖≥16.7 mmol·L－1為2型糖尿病大鼠造模成功。選取成模大鼠40只，隨機分為4組（n＝10）：糖尿病組（D組）、糖尿病假手術組（S組）、糖尿病膿毒癥組（DS組）、糖尿病膿毒癥UTI預處理組（U組）。

1.2 糖尿病膿毒癥大鼠模型 采用李寶貴等［6］的盲腸結扎穿孔術（CLP）方法構建糖尿病膿毒癥大鼠模型。首先采用2%戊巴比妥鈉溶液（2 mL·kg－1）對DS組和U組大鼠進行腹腔麻醉，麻醉后固定，常規消毒鋪單，腹正中線作10 mm切口，以“3-0”絲線盲腸根部結扎，注意避免回腸和盲腸腸系膜血管。用18＃穿刺針兩次貫通穿刺盲腸壁，各擠出0.1 mL腸內容物，最后將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口，術后禁食，自由飲水。U組大鼠手術前1 h給予UTI 10萬U·kg－1，生理鹽水稀釋至1 mL尾靜脈緩慢注射（5 min）。對S組大鼠，常規麻醉消毒，開腹找到盲腸，將其拉出腹外放置1 min，之后還納關腹。

1.3 檢測指標 代謝籠收集各組大鼠術后12 h尿液標本，雙抗體兩步夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）行尿微量白蛋白（UMA）定量檢測。稱體質量，堿性苦味酸法測血尿肌酐，計算內生肌酐清除率（Ccr）。HE染色法觀察腎組織病理改變。ELISA法檢測血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-18（IL-18）的含量。硫代巴比妥酸（TBA）法檢測血清中丙二醛（MDA）含量，黃嘌呤氧化酶法測定大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）活性。Western blot法檢測腎組織低氧誘導因子-1α（HIF-1α）的蛋白表達。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行處理。計量資料以s表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組間比較采用最小顯著差異法（LSD），P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎臟病理學改變 對照組的腎小球和腎小管結構正常，近曲小管管壁充盈，胞質豐富，胞核藍染，邊界清晰；D組及S組腎小球大致正常，而腎小管上皮細胞出現病理損害，可見濁腫現象，部分細胞核淡染；DS組較D組及S組損害更加嚴重，腎小球腎和小管明顯濁腫，管腔狹窄，基底膜增厚，且細胞核淡染，部分核出現濃縮、破碎甚至溶解；U組腎小球結構大致正常，體積有增大，少量腎小管上皮細胞出現濁腫，部分細胞核淡染，但總體的病理損傷較DS組明顯減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織的病理學結果（HE染色×400）

2.2 UMA含量變化 各組間UMA含量不全相同（P＜0.05）；與C組相比，其余各組UMA均升高（P＜0.01）；D組與S組間差異無統計學意義（P＞0.05）；與S組相比，DS組及U組UMA均升高（P＜0.01）；與DS組相比，U組UMA降低（P＜0.05）。見表1。

2.3 Ccr變化 各組間Ccr不全相同（P＜0.05）；與C組相比，其余各組Ccr均降低（P＜0.01）；D組與S組間差異無統計學意義（P＞0.05）；與S組相比，DS組及U組 Ccr降低（P＜0.05）；與 DS組相比，U組Ccr升高（P＜0.05）。見表1。

2.4 血清IL-18和TNF-α含量變化 各組間血清IL-18和TNF-α含量均不全相同（P＜0.05）；與 C組相比，其余各組血清 IL-18、TNF-α均升高（P＜0.01）；D組與S組間的血清IL-18、TNF-α含量均差異無統計學意義（P＞0.05）；與S組相比，DS組血清IL-18、TNF-α均升高（P＜0.05）；與 DS組相比，U組血清 IL-18、TNF-α降低（P＜0.05）。見表1。

2.5 血清MDA含量及SOD活性變化 各組間血清MDA含量及SOD活性均不全相同（P＜0.05）；與C組相比，其余各組血清MDA含量均升高（P＜0.01），SOD活性均下降（P＜0.01）；D組與S組間血清MDA含量和SOD活性差異無統計學意義（P＞0.05）；與 S組相比，DS組 MDA含量均升高（P＜0.05），DS組 SOD活性下降（P＜0.05），U組MDA含量均升高（P＜0.05）、SOD活性下降（P＜0.05）；與DS組相比，U組血清MDA含量下降（P＜0.05），SOD活性升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組不同大鼠各個指標比較／x±s

2.6 腎組織HIF-1α蛋白表達變化 各組間腎組織HIF-1α蛋白表達不全相同（P＜0.05）；與C組相比，其余各組腎組織HIF-1α蛋白表達均升高（P＜0.01）；D組與S組間腎組織HIF-1α蛋白含量差異無統計學意義（P＞0.05）；與S組相比，DS組大鼠腎組織的HIF-1α蛋白表達均升高（P＜0.01），U組HIF-1α蛋白表達也升高（P＜0.05）；與DS組相比，U組腎組織HIF-1α蛋白表達降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 腎臟組織中AIF-1α蛋白表達水平

3 討論

2型糖尿病（T2DM）是一種復雜多樣的疾病，其發病與胰腺β細胞分泌胰島素相對減少和漸進性的胰島素抵抗導致高糖血癥有關［7］。T2DM動物模型眾多，主要有實驗性、自發性和轉基因性T2DM動物模型［8］。本實驗采用高脂飼料加小劑量STZ一次性腹腔注射來建立T2DM大鼠模型。這種方法能在使用小劑量STZ破壞大鼠胰島β細胞功能的同時，輔以高脂飼料造成外周組織對胰島素的敏感性降低，形成類似的T2DM模型。然后我們在T2DM基礎上采用CLP建立大鼠膿毒癥模型，相對于其他直接注射LPS等成分構建膿毒癥模型的實驗方法來說，這種動物模型模仿了人類腸道手術后細菌感染導致膿毒癥的漸進性臨床情境，而不是采用毒素進行一次性打擊造成臟器損傷。有研究顯示，在行CLP術后，機體高動力循環狀態將會持續8 h（術后2 h到術后10 h），機體在術后16 h左右開始進入低動力的虛弱狀態，可持續到20 h左右［9］。另外有研究證實，雌性大鼠在同時行CLP和卵巢切除術后12 h到20 h間的死亡率達到33%，而糖尿病雌性大鼠在同時行CLP和卵巢切除術后6 h到20 h的死亡率則達到40%［10］。本實驗也存在對大鼠行糖尿病和膿毒癥的雙重打擊，故本實驗選擇在CLP術后12 h收集大鼠的血液和腎臟標本進行相關指標的檢測，這樣能在達到實驗目標的同時，使實驗結束時大鼠的死亡率最低。最后，本實驗結果證明，相較于對照組，DS組腎臟腎小球腎小管均嚴重受損，糖尿病膿毒癥大鼠AKI模型構建成功。

UTI是從人類尿液中提純萃取出的含有143個氨基酸的糖蛋白，分子量為67 kDa，能夠有效抑制多種酶和不良刺激引起的炎性因子的釋放，同時也能夠通過穩定溶酶體的細胞膜、吸收氧自由基以及阻止炎性因子的釋放來改善微循環。此外，許多研究顯示，UTI對于AKI都有保護作用［11-12］。而目前關于UTI對患有糖尿病的腸源性膿毒癥大鼠導致AKI的保護作用的研究尚未見報道。而且，在某些患者經歷較大手術如心肺轉流術時，使用UTI治療后測量患者腎臟生物標記物后，發現UTI對于AKI不具有保護性作用［13］。在本研究中，U組相對于DS組，腎臟病理損傷明顯減輕，尿中微量白蛋白的含量明顯降低，Ccr明顯升高。結果說明，在糖尿病膿毒癥大鼠發生AKI時，UTI對于的腎臟功能有明顯保護作用。

TNF-α是膿毒癥級聯反應中重要的炎性因子，早期出現，促進膿毒癥發生發展。IL-18是一種新型的促炎因子，在膿毒癥發病過程中，IL-18起重要作用，而且與膿毒癥的嚴重程度密切相關。有研究發現，在脂多糖（LPS）刺激之前予以UTI預處理治療，血清TNF-α含量能夠顯著降低，炎性反應明顯減輕［14］。但是，UTI在某些實驗模型中的抗炎作用并不十分顯著。在失血性休克患者中使用UTI，患者血中炎性因子如TNF-α和IL-6水平并沒有明顯變化［15］。也有研究發現，UTI能夠降低LPS刺激的單核細胞中TNF-α的含量，但是這種降低幅度并不明顯，不能充分證明UTI抗炎作用的有效性［16］。而在本實驗中發現，大鼠血清中的TNF-α和IL-18，相對于D組和S組，DS組明顯升高；而相對于DS組，U組明顯下降。膿毒癥感染可以明顯加重糖尿病大鼠的全身炎性反應，使用UTI能夠明顯減輕在發生糖尿病膿毒癥時的全身炎性反應，延緩膿毒癥發病過程。

氧自由基損傷是糖尿病膿毒癥時腎臟損傷的重要機制之一，膿毒癥時大量炎性因子釋放誘導活性氧的產生，造成機體內氧化-還原狀態失衡，引起氧化應激，最終導致腎臟損傷，糖尿病更會加速這一過程的發生發展。MDA是脂質過氧化反應重要的代謝終產物之一，其濃度能夠直接反映出機體氧化損傷程度；SOD是機體內清除氧自由基的首要物質，其活性水平高低能夠反應機體抗氧化能力的強弱。本實驗中，相對于D組和S組，DS組大鼠血清中的MDA含量升高，SOD活性降低；相對于DS組，U組大鼠血清中的MDA含量降低，SOD活性升高，變化趨勢與腎臟受損嚴重程度相關。這說明膿毒癥感染明顯加重糖尿病大鼠的全身氧化應激反應；而UTI也是通過減少全身MDA釋放，提升SOD活性水平，從而減少氧自由基，減輕氧化應激反應，來保護腎臟功能。

腎臟組織血流量大，耗氧量高，對缺血缺氧反應敏感，易受缺氧損傷。而HIF-1α是特異性介導細胞低氧反應的核轉錄因子。HIF-1α的蛋白穩定性受細胞內氧濃度的調節，在正常的氧環境中HIF-1α的含量很低，因為在正常氧濃度時，HIF-1α可以持續產生，但是卻很快被脯氨酰羥基化酶羥基化，最終被泛素-蛋白酶系統分解；在缺氧時，細胞中的脯氨酰羥基化酶活性降低，HIF-1α不能被分解，于是在細胞中大量積聚［17］。因此，腎臟中HIF-1α蛋白的表達水平能夠直接反映腎臟的缺氧情況。在本實驗中發現，腎臟HIF-1α蛋白表達水平，DS組相對于D組和S組明顯升高，U組相對于DS組明顯降低。這說明在糖尿病膿毒癥大鼠腎臟組織中顯著缺氧，而UTI能夠改善腎臟缺氧狀態，降低HIF-1α表達，保護腎臟功能。

本實驗成功構建大鼠糖尿病膿毒癥致AKI模型，證實UTI預處理能有效改善大鼠的腎功能，減輕AKI，其機制可能與UTI能夠抑制炎性反應、降低氧化應激、改善腎臟缺氧情況有關。

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