miRNA-223-3p在不明原因復發性流產患者絨毛組織中表達以及在血管生成中的作用

高玉霞，董學彩，王文翔，盛修貴

（1.新鄉市中心醫院婦科，河南 新鄉 453000；2.山東省腫瘤醫院婦科，山東濟南 250100）

不明原因復發性流產是指在排除染色體、解剖、感染、免疫、內分泌等因素后，育齡期婦女與同一性伴侶連續發生自然流產超過2次，約占復發性流產的40%～80%［1］，該病發生機制較為復雜，涉及多因素、多步驟，目前尚未研究清楚。研究表明［2］，絨毛血管增生、滋養細胞增殖、侵襲對正常妊娠至關重要，妊娠早期胚胎發育在相對乏氧環境中進行，乏氧可對滋養細胞侵襲及絨毛血管生成進行調節。因此，乏氧可能在不明原因復發性流產中發揮重要作用。微小RNA（miRNA）作為一種短小單鏈非編碼RNA，在調控細胞增殖、分化、組織和器官發育、血管生成等多種生物學功能中發揮重要作用［3］，miRNA-223-3p作為 miRNA重要類型之一，P70核蛋白體激酶（Rps6kb1）可能是其潛在靶基因或直接作用基因［4］，而Rps6kb1亦是mTOR信號通路下游重要的傳遞分子［5］，研究表明［6］，mTOR信號通路在調控缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）表達中發揮重要作用。HIF-1α是調控缺氧環境下血管新生中發揮關鍵性作用［7］。本研究擬對不明原因復發性流產患者絨毛組織中miRNA-223-3p表達進行檢測，分析其對Rps6kb1／HIF-1α信號通路的影響，以期為發生不明原因復發性流產發生的可能機制提供線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年5月—2015年6月在新鄉市中心醫院不明原因復發性流產患者57例，年齡23～34歲，平均年齡（27.6±4.2）歲，孕齡51～69 d，臨床表現陰道出血或腹痛，B超提示無原始心管搏動，臨床確診為難免流產，排除解剖結構異常、染色體異常、感染、免疫、內分泌等原因引起的流產，均連續出現自然流2次及以上，其中，2～3次36例，≥4次21例。同期，選取正常早孕行人工流產術患者42例作為對照組，年齡24～36歲，平均年齡（28.2±4.5）歲，孕齡48～63 d，B超檢查及血絨毛膜促性腺激素檢查均正常，無先兆流產癥狀，均排除解剖結構異常、染色體異常、感染、免疫、內分泌等疾病。所有患者行清宮術后留取絨毛組織，每份標本分成2份，1份用生理鹽水沖洗后保存于－70℃冰箱中以備檢，另1份用甲醛固定后，脫水、包埋、切片，保存于4℃條件下。本研究通過醫院倫理委員會批準，所有患者均行知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和設備 TRIzol總RNA提取試劑盒由寶生物工程（大連）有限公司提供，逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒均由天根生化科技（北京）有限公司提供，miRNA-223-3p、Rps6kb1、HIF-1α、血管內皮生長因子（VEGF）及內參引物序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成，鼠抗人血管內皮細胞CD34單克隆抗體、HRP標記山羊抗鼠二抗和免疫組化SP法染色試劑盒由北京中杉金橋生物技術有限公司提供，紫外分光光度計購自上海譜元儀器有限公司，實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2.2 利用實時熒光定量PCR技術檢測絨毛組織中 miRNA-223-3p、Rps6kb1、HIF-1α和 VEGF表達取絨毛組織，研磨后加入細胞裂解液裂解，用TRIzol總RNA提取試劑盒對總mRNA進行提取，并用紫外分光光度計檢測純度，以A260／A280≥1.80作為合格樣品。用逆轉錄試劑盒將總mRNA逆轉錄為單鏈模板鏈cDNA，以cDNA為模板用PCR反應試劑盒進行 PCR，引物序列見表 1。PCR反應條件：94℃ 60 s，94℃ 45 s，56℃ 45 s，74℃ 30 s，連續進行38個循環，以內參為對照，用2－△△Ct法獲得絨毛組織中 miRNA-223-3p、Rps6kb1、HIF-1α和 VEGF表達量。

表1 引物序列

1.2.3 免疫組化法檢測絨毛組織中微血管密度（MVD） 取絨毛組織切片，脫蠟、水化后，進行抗原修復，加入3%H2O2以使內源性過氧化物沒失活。將鼠抗人血管內皮細胞CD34單克隆抗體（1∶500稀釋）加入，4℃下過夜孵育，以PBS代替一抗作為陰性對照，將HRP標記山羊抗鼠二抗（1∶800）加入，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，DAB顯色30 min，蘇木素復染，中性樹膠封片，于高倍鏡下觀察。微血管陽性判定標準：血管內皮細胞或細胞簇出現棕黃色染色，管腔由8個以上紅細胞組成，有肌層的不計在內。每個切片均取5個視野進行計數，取均值作為MVD。

1.3 統計學方法 利用SPSS 21.0統計分析軟件進行統計學處理。觀測資料主要為正態計量資料，采用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗。此外利用Pearson相關分析對變量間相關關系進行分析。P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者絨毛組織中 miRNA-223-3p、Rps6kb1、HIF-1α和VEGF表達比較 不明原因復發性流產患者絨毛組織中miRNA-223-3p表達量高于對照組，而 Rps6kb1 mRNA、HIF-1αmRNA和VEGF mRNA表達量均低于對照組，均差異有統計學意義（t＝17.058、11.947、10.477和 13.383，P＜0.05）；≥4次不明原因復發性流產患者miRNA-223-3p表達量高于2～3次和對照組，而Rps6kb1 mRNA、HIF-1αmRNA和VEGF mRNA表達量低于2～3次和對照組，均差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

2.2 兩組患者絨毛組織中MVD比較 免疫組化結果顯示，不明原因復發性流產患者絨毛組織中血管發育不良，血管數量減少，管腔變小或消失，見圖1。不明原因復發性流產患者絨毛組織中MVD為（23.3±6.1）個，遠低于對照組的（41.6±5.3）個，差異有統計學意義（t＝15.476，P＜0.001），≥4次不明原因復發性流產患者絨毛組織中MVD為（18.5±3.7），低于2～3次的（26.8±4.1），差異有統計學意義（t＝7.034，P＜0.001）。

2.3 不明原因復發性流產患者絨毛組織中miRNA-223-3p表達量與HIF-1α和VEGF表達量及MVD相關性 Pearson相關分析顯示，不明原因復發性流產患者絨毛組織中miRNA-223-3p表達量與HIF-1αmRNA和VEGF mRNA表達量及MVD均呈負相關（r＝－0.496、－0.638和 －0.597，P＜0.001）；HIF-1αmRNA表達量與VEGF mRNA表達量和MVD均呈正相關（r＝0.584和0.439，P＜0.001）；VEGF mRNA表達量與MVD呈正相關（r＝0.600，P＜0.001）。

3 討論

復發性流產作為婦產科常見的疾病，發生率約為1%～5%，且隨著流產次數增加而再次發生的風險隨之增加［8］，目前，大部分復發性流產患者不能找到明確原因，對于這部分患者主要采取注射免疫球蛋白、抗凝血等免疫治療手段，但仍有20%～30%患者無效［9］，提示不明原因復發性流產患者仍存在其他病因和機制。研究表明［10］，妊娠早期胚胎在相對缺氧的環境中進行，局部氧分壓變化可通過調節滋養細胞侵襲能力及絨毛血管生成而影響胚胎發育。HIF-1α作為受氧濃度調節的轉錄因子，是缺氧環境下誘導血管生成的關鍵性調控因子［11］，VEGF作為調控血管生成的中樞性物質，可促進血管內皮細胞及滋養細胞增殖而加速血管生成［12］。有研究指出［13］，早孕期宮腔缺氧可誘導滋養細胞表達HIF-1α，HIF-1α可通過促使 VEGF等的表達而促進滋養層細胞增殖及血管生成，以維持胚胎發育所需營養物質供應。本研究顯示，不明原因復發性流產患者絨毛組織中HIF-1αmRNA和VEGF mRNA表達量均低于對照組，≥4次不明原因復發性流產患者HIF-1αmRNA和VEGF mRNA表達量低于2～3次和對照組，說明不明原因復發性流產患者早孕期絨毛組織中HIF-1α和VEGF表達量降低，且隨著流產次數增多這種抑制作用越強，提示不明原因復發性流產可能與絨毛組織中HIF-1α和VEGF表達下調有關。

表2 兩組患者絨毛組織中miRNA-223-3p、Rps6kb1、HIF-1α和VEGF表達比較／x±s

圖1 兩組患者絨毛組織中MVD（SP法×400）

miRNA-223-3p定位于Xq12，可通過調控其靶基因而調節細胞增殖、凋亡過程，與多種惡性腫瘤發生及侵襲、轉移過程有關［14］。研究表明［15］，miRNA-223-3p可作為抑癌基因而發揮作用，可通過調控Artemin、IGF-1R等靶點而抑制實體腫瘤的增殖及侵襲、轉移。亦有研究指出［16］，miRNA-223-3p可直接調控IGF-1R下游Akt／mTOR／Rps6kb1信號通路而調控細胞增殖。本研究顯示，不明原因復發性流產患者絨毛組織中miRNA-223-3p表達量高于對照組，≥4次不明原因復發性流產患者miRNA-223-3p表達量高于2～3次和對照組，說明miRNA-223-3p在不明原因復發性流產患者絨毛組織中表達上調，且與流產次數有關，提示miRNA-223-3p表達上調可能與不明原因復發性流產有關。本研究顯示，不明原因復發性流產患者絨毛組織中Rps6kb1 mRNA表達量均低于對照組，≥4次患者Rps6kb1 mRNA表達量低于2～3次和對照組，說明不明原因復發性流產患者絨毛組織中Rps6kb1信號分子被抑制，Pearson相關分析顯示，不明原因復發性流產患者絨毛組織中miRNA-223-3p表達量與HIF-1αmRNA和 VEGF mRNA表達量均呈負相關（r＝－0.496、－0.638，P＜0.001），免疫組化結果亦顯示，不明原因復發性流產患者絨毛組織中MVD遠低于對照組，提示不明原因復發性流產患者絨毛組織中高表達miRNA-223-3p可能通過抑制Rps6kb1／HIF-1α信號通路而使HIF-1α和VEGF表達降低，使絨毛組織對低氧環境耐受性降低，使血管生成數量減少，導致MVD降低，而使滋養層及胎盤血供不足，使早孕兒血循環障礙而導致流產發生。

綜上所述，miRNA-223-3p在不明原因復發性流產患者絨毛組織中表達上調，可能與Rps6kb1／HIF-1α信號通路有關。

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