端粒長度與動脈粥樣硬化性腦梗死及斑塊穩(wěn)定性的相關研究

李丹青，李淮玉，李靜，張梅

（1.安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院神經內科，安徽合肥 230001；2.淮南市第一人民醫(yī)院神經內科，安徽淮南 232000）

隨著我國逐漸邁入老齡化社會，糖尿病、高血脂、高血壓等基礎疾病的發(fā)病率逐漸提高，與此相關的腦血管疾病更上升為第一位死亡和致殘的疾病，成為危害中老年人健康和生活質量的常見病和多發(fā)病。其中缺血性卒中尤其是大動脈粥樣硬化性缺血性卒中在臨床實踐中更是極為常見。

有研究表明，動脈粥樣硬化所造成的腦血管狹窄以及斑塊的形成和不穩(wěn)定性是缺血性腦卒中尤其是大動脈粥樣硬化性缺血性卒中發(fā)生的根本原因，且斑塊的不穩(wěn)定性相較于血管狹窄可能更為危險［1］。

既往對動脈粥樣硬化性腦梗死的研究，多集中在動脈粥樣硬化過程中的慢性炎癥方面，尤其是促進動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊形成及發(fā)展的炎性因子及抗炎因子，而很少涉及到細胞老化方面。而眾所周知，動脈粥樣硬化的始動環(huán)節(jié)恰恰是血管內皮細胞的老化及功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)：端粒可以被認為是細胞衰老的生物鐘。端粒越短，表明細胞分裂能力越差，剩余的分裂次數(shù)越少；端粒越長，則表明細胞分裂能力強，剩余的分裂次數(shù)多。端粒的縮短參與細胞的衰老。發(fā)生在血管中，端粒的損耗可能會導致血管內皮細胞、內皮祖細胞以及平滑肌細胞衰老和功能障礙，進而參與動脈粥樣硬化（AS）的病理演進［2-6］，最終引發(fā)相應的心腦血管疾病。

外周血白細胞端粒長度（LTL）與腦卒中的相關研究尚不多且結果并非完全一致，與大動脈粥樣硬化性腦梗死的研究則更少。此外，LTL與缺血性卒中發(fā)生密切相關的斑塊的穩(wěn)定性研究國內外則更難以找到。因此，本文旨在研究LTL與大動脈粥樣硬化性腦梗死及動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年12月—2016年9月入住安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院神經內科的急性前循環(huán)梗腦死患者（年齡40～86歲）70例作為觀察組，以及與之年齡、性別匹配的來自安徽省立醫(yī)院檢中心的健康體檢者68例（年齡47～90歲）作為對照組。根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)，神經系統(tǒng)查體、影像學檢查，由神經內科兩位主治以上職稱醫(yī)師確診。所有患者均根據(jù)2010年中國急性缺血性卒中診治指南的診斷標準確診［7］。排除系統(tǒng)性疾病（如膠原性疾病、炎癥、肝臟或腎臟疾病、代謝性疾病等），排除心源性卒中、其他原因引起的缺血性腦卒中，如血管壁炎癥：結核性、梅毒性、化膿性、鉤端螺旋體感染、結締組織病、變態(tài)反應性動脈炎等；夾層動脈瘤、脫水、全身感染、先天性血管畸形、真性紅細胞增多癥、高凝狀態(tài)、吸毒等繼發(fā)的缺血性腦卒中以及原因不明性的腦卒中。記錄研究對象的基線臨床資料包括年齡、性別、血脂、血糖、尿酸、吸煙史、飲酒史、糖尿病史、高血壓史、冠心病史等。同時，記錄觀察組的頸動脈超聲檢查結果。實驗排除14例研究對象，其中包括質量不好的DNA以及加樣不好的DNA。最終納入70例前循環(huán)大動脈粥樣硬化性腦梗死患者作為觀察組，以及68例健康體檢者作為對照組，使用實時熒光定量PCR儀檢測其外周血白細胞相對端粒長度。

1.2 實驗方法

1.2.1 檢測端粒長度［8-9］所有對象均于入組次晨空腹抽取靜脈血2 mL－20℃保存以用來提取外周血白細胞DNA，外周血細胞DNA提取試劑盒購自于北京康為世紀公司，操作步驟嚴格按照操作說明書來進行。DNA提取完成后，使用紫外分光光度計測定DNA濃度和純度，若樣品OD260／OD280在1.7～1.9之間，表明DNA純度符合要求，然后稀釋DNA樣本至100 mg·L－1以下。若未達到上述要求，說明提取的DNA不純，予以舍棄或重新提取DNA，直至符合要求。經過上述過程，最終所有樣本的DNA濃度和純度均能達到實驗要求。然后使用實時熒光定量PCR進行外周血白細胞端粒的檢測。

原理：相對端粒長度可以通過使用實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測外周血白細胞端粒重復拷貝數(shù)（T）和單拷貝基因-globin的拷貝數(shù)（S），用端粒重復拷貝數(shù)T和-globin基因拷貝數(shù)的比值T／S表示。實時熒光定量PCR中，Ct值表示每個反應管內的熒光信號到達設定域值時的循環(huán)數(shù)。相對端粒長度（T／S）＝2－［Ct（telomere）－Ct（β－globin）樣品］／2－［Ct（telomere）－Ct（β－globin）標準品］。使用實時熒光定量PCR儀測量相對端粒長度時，采用雙標準曲線法。提取培養(yǎng)的HEK293S細胞DNA作為標準品以設立標準曲線。其稀釋梯度如下：293標準品 100μg·L－1→梯度 200，100，50，25，12.5，6.25，3.125μg·L－1。

其反應體系為20μL，采用SYBR＠Green。

根據(jù)相關文獻，其引物序列如下：

Telomere-F：5′CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT 3′

Telomere-R：5′GGCTTGCCgTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT3′

β-globin-F：5′GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC3′

β-globin-R：5′CACCA ACTTCATCCACGTTCACC3′

反應條件：Telomere：95℃，15 s；54.3℃，60 s。

Globin：95℃，15 s；56℃，60 s。

1.2.2 頸動脈血管超聲檢查 對每一位入組患者，使用多普勒超聲診斷儀進行頸動脈血管超聲檢查，檢查前調整探頭頻率在7.5～10 MHz之間。檢查時囑患者取仰臥位并充分放松，幫助患者頭部轉向檢查者的對側以充分暴露頭頸部，這樣更有利于檢查。然后將超聲探頭放置于被檢查者胸鎖乳突肌的前緣或后緣，從一側頸動脈的起始處采用橫向和縱向的方式依次探查，檢查完畢后再使用相同的方法檢查另一側。斑塊形成定義為頸動脈局部IMT≥1.2 mm或者≥臨近中間內中膜厚度的1.5倍。根劇頸動脈超聲斑塊的回聲特點，將斑塊分為穩(wěn)定性斑塊和不穩(wěn)定性斑塊。若回聲較高或不均質，則提示斑塊較穩(wěn)定，若回聲較低或出現(xiàn)不規(guī)則無回聲區(qū)，則提示斑塊不穩(wěn)定，如脂質型軟斑塊、混合型斑塊等。通過斑塊內部回聲特點，將70例患者分為不穩(wěn)定頸動脈粥樣硬化斑塊組和穩(wěn)定頸動脈粥樣硬化斑塊組。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對收集的數(shù)據(jù)進行處理。當P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。首先采用Kolmogorov-Smirnov正態(tài)分布檢驗法對所有計量資料進行變量分布的檢驗，符合正態(tài)分布的資料用x±s表示。然后進行方差齊性檢驗，如果方差齊，兩組間差異比較用 t檢驗；若方差不齊，兩組間差異比較采用t′檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料，如本文中的三酰甘油，使用中位數(shù)、四分位數(shù)間距表示，組間比較采用Mann-Whitney秩和檢驗。計數(shù)資料用頻數(shù)（百分比）表示，兩組間差異的比較采用χ2檢驗。其中，白細胞端粒長度在統(tǒng)計學分析之前，首先要進行相應的數(shù)據(jù)處理，即取T／S值的自然對數(shù)用于統(tǒng)計學處理。

2 結果

2.1 基線資料比較 本次研究共納入研究對象138例，其中觀察組大動脈粥樣硬化性腦梗死患者70例，對照組健康體檢者68例。觀察組男45例，女25例，年齡40～86歲，平均年齡65.39歲。對照組男40例，女28例，年齡47～90歲，平均年齡62.22歲。性別分布采用χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。年齡符合正態(tài)分布采用t檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。故觀察組及對照組性別年齡相匹配，具有可比性。其他血管危險因素，觀察組和對照組在性別、年齡、三酰甘油、尿酸間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），然而在總膽固醇及高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL），高血壓病史、糖尿病病史、吸煙史及飲酒史中差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。這與既往的研究大致相符合，體現(xiàn)了上述因素為血管危險因素。

2.2 觀察組與對照組間端粒長度的比較 觀察組外周血端粒長度1.31（0.88～1.94），對照組LTL 1.84（1.06～2.63），取相對端粒長度的自然對數(shù)進行統(tǒng)計學分析，Kolmogorov-Smirnov正態(tài)分布檢驗法檢驗變量的分步，不符合正態(tài)分布，組間比較采用用非參數(shù)檢驗中的Mann-Whitney秩和檢驗，結果發(fā)現(xiàn) Mann-Whitney（Z）＝－3.158，P＝0.002，差異有統(tǒng)計學意義。說明端粒縮短與大動脈粥樣硬化性腦梗死可能具有一定的相關性。但并不能排除其他危險因素可能造成的差異。下面進一步分析，端粒長度與頸動脈斑塊的關系。

2.3 穩(wěn)定斑塊組與不穩(wěn)定斑塊組間端粒長度的比較 觀察組按照頸動脈彩超的檢測結果分為不穩(wěn)定斑塊組（40例）以及穩(wěn)定斑塊組（30例）。不穩(wěn)定斑塊組端粒長度（1.48±0.78），明顯短于穩(wěn)定斑塊組（1.72±0.49）。Kolmogorov-Smirnov正態(tài)分布檢驗法檢驗變量的分步，符合正態(tài)分布，不符合方差齊性，故組間比較采用近似 t檢驗，結果 t′＝－3.750，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。這說明端粒縮短可能與斑塊的形成及不穩(wěn)定性相關。

3 討論

端粒是位于真核細胞染色體末端的線性DNA蛋白質復合體。其由短串聯(lián)重復序列TTAGGG及端粒結合蛋白構成。端粒的單鏈DNA3′端與端粒結合蛋白結合形成1個被稱為T環(huán)的端粒環(huán)。T環(huán)可以看做染色體的“帽”結構，其可以隱藏染色體DNA末端，防止染色體 DNA末端被核酸酶降解［10］，從而起到保護作用。但是由于線性DNA復制時具有不完全特性，即每次細胞分裂端粒都可能會丟失一小部分序列（大約50～200 bp），因此，端粒會隨著細胞的不斷分裂會進行性縮短。一定限度的縮短并不會影響細胞的基本生命活動，但當端粒縮短到無法維持T環(huán)時，那么端粒就無法保護染色體的末端，染色體將失去穩(wěn)定性，發(fā)生畸變、斷裂或缺失，細胞將進入衰老和死亡。因此端粒被稱為細胞衰老的生物鐘。端粒越短，細胞分裂能力越差，剩余的分裂次數(shù)越少；端粒越長，細胞分裂能力強，剩余的分裂次數(shù)多。端粒的損耗可能會導致血管內皮細胞、內皮祖細胞以及平滑肌細胞衰老和功能障礙，進而參與動脈粥樣硬化的病理演進［2-6］，最終引發(fā)相應的心腦血管疾病。

表1 觀察組和對照組血管危險因素的比較

近年來對于LTL與卒中發(fā)生、發(fā)展相關性研究，尚不是很多且存在差異。Ding等［11］納入腦卒中患者及健康對照組各1 309例，比較其外周血端粒長度，結果觀察組LTL比對照組顯著縮短，進一步隨訪其中858例腦卒中患者5年，發(fā)現(xiàn)端粒長度縮短可以預測卒中后的死亡風險。哈佛醫(yī)學院在護士健康研究中心和醫(yī)生健康研究中心進行前瞻性的研究，采用巢式病例對照研究的方法［12］，結果發(fā)現(xiàn)LTL與年齡成反比，觀察組與對照組端粒長度差異無統(tǒng)計學意義，并未說明端粒長度與腦卒中之間的聯(lián)系。一項來自歐洲的研究也未說明端粒長度與腦卒中之間的聯(lián)系［13］。國內相關研究尚不多，Zhang等［14］大樣本前瞻性病例對照研究，選取1 801名健康體檢者作為對照組、1 756例卒中患者作為觀察組（其中動脈粥樣硬化性腦梗死767例，腔隙性腦梗死503例，腦出血486例），然后隨訪4.5年。通過回歸分析在校正危險因素后，最終得出的結果是，動脈粥樣硬化性腦梗死患者，端粒較短者發(fā)生全因死亡的風險增加69%，心腦血管死亡風險是長端粒組的2.57倍。并未發(fā)現(xiàn)腔隙性腦梗死和腦出血端粒縮短與全因死亡和心腦血管死亡風險的關系。在此基礎上，李靜等［15］對外周血白細胞相對端粒長度與腦卒中的相關性進行了研究，他們進行的是病例對照研究，納入了觀察組初發(fā)腦卒中患者543例（其中224例為動脈粥樣硬化性腦梗死）和健康對照組616例作為對照組，RT-PCR檢測相對端粒長度。通過多元Logistic回歸模型分析腦卒中與端粒長度的關系，最終并未發(fā)現(xiàn)端粒長度與腦卒中之間相關，在進一步對卒中亞型的分析過程中，得出動脈粥樣硬化性腦梗死組與對照組比較，端粒長度顯著縮短。這與之前Zhang等［14］的研究是相符合的。Ding等［11］的病例對照研究，結果亦顯示腦卒中患者端粒長度較對照組顯著縮短；動脈粥樣硬化性腦梗死和腔隙性腦梗與對照組比較，端粒長度顯著縮短；而腦出血與對照組比較端粒長度差異無統(tǒng)計學意義。以上這些研究提示，LTL并非是與各類型卒中均存在相關性，其主要與大動脈粥樣硬化性腦梗死有關。本次研究結果也證明了端粒長度與大動脈粥樣硬化性腦梗死存在相關且LTL可能成為預測急性動脈粥樣硬化性腦梗死的生物指標。猜測原因，端粒長度的縮短可能是通過促進動脈粥樣的發(fā)生發(fā)展來促進動脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)生。

端粒與動脈粥樣硬化的研究由來已久，源于Chang等［16］的研究，他們發(fā)現(xiàn)受到較大血管動力應力組的內皮細胞端粒損耗率高于另一組。因此Chang等認為端粒長度可以用來反映動脈粥樣硬化的演進過程，而老化的血管細胞的可能在動脈粥樣硬化中起了很大作用。在Chang研究的基礎上，Okuda等［17］通過比較腹主動脈遠端和近端內皮細胞的DNA端粒長度，發(fā)現(xiàn)遠端腹主動脈內層和中層細胞的端粒長度與其動脈粥樣硬化的程度成反比，進一步支持了Chang等［16］的觀點。美國弗明漢心臟研究組報道，在肥胖男性個體中端粒縮短是頸動脈內膜-中膜厚度（IMT）增厚的獨立預測因子；一項對男性頸動脈粥樣硬化斑塊和端粒長度的研究［18-19］發(fā)現(xiàn)頸動脈粥樣硬化越明顯，端粒長度越短。Chen等［20］研究了美洲印第安人的短端粒長度與動脈粥樣硬化的發(fā)生及進展的關系，該研究是前瞻性隊列研究，納入2 819個在基線時間段（2001—2003年）無心血管疾病的參與者，最終隨訪到2006—2009年（平均隨訪時間是5.5年），結果提示低端粒長度與斑塊的發(fā)生及進展相關。上述研究從流行病學角度說明了端粒長度與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展相關，本次研究結果與此相符，表現(xiàn)為不穩(wěn)定斑塊組LTL低于穩(wěn)定斑塊組，結合大動脈粥樣硬化性腦梗死的病因及發(fā)病機制，猜測LTL促進大動脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)生可能是通過影響斑塊的性質，促進斑塊破裂來實現(xiàn)的。

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