激素濃度對羔羊和成年母羊卵母細胞體外成熟培養的影響

秦康樂　郭海燕　李擁軍

摘要：以江蘇省本地白山羊羔羊為主要研究對象，經羔羊屠宰場取卵后進行體外成熟培養，在成熟培養液里添加不同濃度的促卵泡激素（FSH）和促黃體生成素（LH），探討FSH和LH對卵母細胞成熟率的影響。并對比羔羊與母羊的后期胚胎發育能力，以探究卵母細胞成熟的調控機制。在成熟液里添加濃度為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μg/mL 的FSH+LH，成熟培養后，其結果顯示成熟液中添加不同濃度FSH和LH對卵母細胞成熟率有顯著影響。其中成熟液中添加5.0 μg/mL FSH和LH濃度的羔羊卵母細胞成熟率明顯高于其他4組；成熟液中添加10.0 μg/mL FSH和LH濃度的成年母羊卵母細胞成熟率明顯高于其他4組；且羔羊和成年母羊卵母細胞在相同濃度成熟液中培養的效果無明顯差異（P>0.05）。

關鍵詞：羔羊；卵母細胞；體外成熟；促卵泡激素（FSH）；促黃體生成素（LH）

中圖分類號： S826.3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）15-0147-03

卵母細胞的成熟包括核、胞質以及尚在研究中的分子成熟。核成熟的標準是卵母細胞是否排出第一極體[1-2]；細胞質成熟在卵母細胞成熟過程沒有明確的標準，但研究者在試驗過程中通常把顆粒細胞擴散程度、第一極體排除及卵周隙增加情況等作為評價胞質成熟的指標[3]；大量研究表明，盡管生長完全的卵母細胞能夠經歷正常的減數分裂和胞質成熟，但僅有小部分能夠發育至囊胚階段[4]，而且通過觀測超微結構的變化難以評價卵母細胞間發育能力的差異，為此一些學者提出分子成熟的推測，即卵母細胞排卵前在母體內積累了大量的母源mRNA和蛋白質，獲得了接下來受精后發育至胚胎的能力，也稱“卵母細胞的獲能”[5]。只有在卵母細胞核、胞質以及分子都成熟的條件下，才能進行正常的受精、受精卵分裂以及最終發育成囊胚。不過，研究者在實際試驗過程中，常以卵丘細胞的擴展程度以及第一極體的排出作為卵母細胞成熟的標準[6]。

卵母細胞成熟是一個伴隨著各種生理生化反應、復雜、動態的過程，在這個過程中很多因素影響其最終結果。經前人多年研究，培養液、空氣成分、溫度、濕度、pH值、時間控制等因素都有了明確的參考，卵母細胞體外成熟培養體系也已經形成并成效顯著，但是卵母細胞體外成熟后的發育能力仍不如體內成熟后的發育能力[7]。作為幼畜體外胚胎生產和移植技術的重要內容，卵母細胞體外成熟是體外受精和體外胚胎培養的重要基礎環節，對揭示卵母細胞的成熟機理具有重要意義，為胚胎工程的研究提供了大量的試驗材料。

而激素作為哺乳動物卵母細胞體內成熟的基礎調節物，在卵母細胞體外成熟過程中發揮重要作用。FSH和LH是卵母細胞體外成熟液中最常用的2種促性腺激素，此外還有雌二醇E2和孕馬血清促性腺激素PMSG也可在體外促進卵母細胞成熟。大量研究表明，FSH和LH在體外成熟培養中，協同促進成熟且在成熟液濃度相等時效果最好，但是不同研究得出的最佳濃度并不一樣，這與山羊品種、季節和地域等因素息息相關。因此，本研究通過在卵母細胞成熟液中添加不同濃度FSH和LH，分別研究FSH和LH對羔羊以及成年母羊卵母細胞體外成熟的影響，并對兩者進行對比研究，以期完善羔羊卵母細胞體外成熟技術，提高羔羊卵母細胞的成熟效果，為后續的胚胎試驗奠定基礎。

1材料和方法

1.1試驗材料

胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），購自GIBCO公司；透明質酸酶，購自Solarbio公司；FSH、LH、雌二醇（E2），購自Bioniche公司；HEPES、BSA（bovine serum albumin），購自Genyiew公司；礦物油（mineral oil），購自美國SIGMA公司。

成熟基礎液配制：TCM199，NaHCO3 2.2 g/L，丙酮酸鈉25.0 mg/L，HEPES 4.8 g/L，青霉素鈉和硫酸鏈霉素各 100 IU/mL。

1.2試驗方法

1.2.1試驗分組試驗分為5組，在成熟基礎液中分別添加不同劑量的激素（表1）。

1.2.2卵巢的采集

本試驗在江蘇省南通市海安縣山羊交易市場采集樣本。選擇江蘇本地白山羊品種、健康的1～2年齡成年母羊和2月齡羔羊進行試驗，在屠宰過程中獲取其新鮮的卵巢，裝入樣品袋，編號后放置于冰塊上，2～4 h內運回試驗室。

1.2.3卵母細胞的收集

卵巢運回試驗室后，用手術剪刀快速去除其表面多余組織，用38.5 ℃的卵巢洗滌液清洗3次后放入裝有PBS的培養皿中。把培養皿放置于39 ℃的溫控板上，挑選表面直徑為1～5 mm的卵泡，用無菌鑷子固定卵巢，用手術刀輕輕劃破卵泡，再用注射器吸取PBS沖洗劃破的卵泡，匯集沖洗液，靜置1 min后在體視顯微鏡下檢卵，用口吸管挑選出形態正常、胞質均勻且包有1層以上完整卵丘細胞的卵丘-卵母細胞復合體（COCs），隨機分組進行對比試驗。

1.2.4卵母細胞成熟培養

成熟培養采用微滴培養法，微滴上覆蓋石蠟油。本試驗選用35 mm直徑的培養皿，可放置4個微滴，每個微滴50 μL成熟液。把挑選好的卵丘-卵母細胞復合體用口吸管移入平衡2 h之后的微滴中洗滌3次，放置在最后1個微滴中。最后把各試驗組培養皿移入38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度條件的培養箱中培養24～26 h，羔羊則為22～24 h。培養結束時可先通過觀察卵丘顆粒細胞的擴散狀況來初步判斷卵母細胞整體成熟效果是否良好，然后把卵丘-卵母細胞復合體放入透明質酸酶溶液微滴里，用槍頭快速吹打以剝離顆粒細胞，收集卵母細胞裸卵，并在倒置顯微鏡下觀察是否成熟，以細胞分出第一極體為成熟標準（圖1）。

[TPQKL1.tif；S+4mm]

1.3數據處理endprint

試驗數據采用SPSS17.0軟件中單因子分析和獨立樣本 t檢驗進行統計分析，并用LSD法進行差異顯著性檢驗，P<005表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。結果用“平均數±標準差”表示。

2結果與分析

2.1不同濃度FSH和LH對成年母羊卵母細胞體外成熟的影響

成年母羊卵母細胞體外成熟率見表2。

3討論與結論

3.1激素對卵母細胞體外成熟效果的影響

FSH可以誘導卵丘細胞擴散，這是卵母細胞成熟的前提條件。FSH能促進卵丘細胞增生分化、向外擴展并刺激卵丘細胞產生一種能促進卵母細胞成熟的細胞因子[8]。FSH還可以促進顆粒細胞分泌雌激素，間接調節卵母細胞成熟[9]。有研究表明，FSH能維持顆粒細胞內高水平的cAMP，從而抑制卵母細胞減數分裂即成熟，使核成熟的同時胞質也能充分成熟，提高了卵母細胞的成熟率及后期胚胎發育潛力。但有人認為，促性腺激素抑制卵母細胞的成熟，FSH不僅抑制胞質和細胞核的成熟，而且對減數分裂紡綞體有損害[9]。由此可見，FSH對卵母細胞成熟的具體影響還沒有研究透徹。

在動物體內，FSH可以與顆粒細胞表面的受體結合，分泌雌二醇，誘導卵泡膜上LH受體的生成，濾泡細胞表面FSH受體數目增加，隨著雌二醇濃度的不斷升高而分泌LH。LH濃度積累形成LH峰，使經卵丘細胞運輸到卵母細胞并抑制卵母細胞成熟的物質如cAMP減少，激發卵母細胞第一次減數分裂的啟動一直到成熟排出第一極體[10]。由此可見，在卵母細胞成熟過程中，FSH、LH、E2等多種激素參與了調控。因此，在體外培養時，多種激素協同作用提高卵母細胞成熟率還需要繼續深入研究。

3.2羔羊與成年母羊卵母細胞成熟率的差異

本試驗中，羔羊卵母細胞成熟率與成年母羊卵母細胞成熟率并無顯著差異，這與Ledda等的研究[11]一致。只是此成熟率表示的是出現第一極體（核成熟）的概率，卵母細胞的胞質并不一定完全成熟，而且羔羊卵母細胞的胞質容易產生成熟不完全或紊亂，對后期胚胎發育影響巨大。由試驗結果可知，成年母羊卵母細胞在FSH和LH濃度都為10.0 μg/mL的成熟液中培養時，成熟率最高；而羔羊在FSH和LH濃度都為 5.0 μg/mL 的成熟液中培養時，成熟率最高。羔羊所需激素濃度與成年羊不一樣，這可能是由于羔羊對激素敏感度高即激素應答能力強，可以用少量的激素發揮出與成年母羊一樣的成熟效果；也可能是由于幼齡動物的卵母細胞在形態、代謝和超微結構等方面與成年動物的卵母細胞有所不同[12]，羔羊對激素的代謝速度慢，更多的激素積聚在細胞質內與受體結合發揮作用。但是造成這種差別的確切機制有待進一步深入研究。

3.3結論

羔羊卵母細胞成熟培養時，在成熟液中添加濃度為 5.0 μg/mL 的FSH和LH，成熟率明顯提高；成年母羊卵母細胞成熟培養時，在成熟液中添加濃度為10.0 μg/mL的FSH和LH，成熟率明顯提高；而且羔羊和成年母羊卵母細胞在相同成熟液中培養的效果無明顯差異（P>0.05）。

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