冷凍電子顯微鏡：生物大分子精細(xì)結(jié)構(gòu)分析的利器

吳趙龍 毛有東

2017年，瑞典皇家科學(xué)院將諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予3位生物物理學(xué)家，Jacques Dubochet，Joachim Frank和Richard Henderson，以表彰他們在發(fā)展冷凍電子顯微鏡（cryoelectronmicroscopy，cryo-EM）方法學(xué)用于解析生物大分子高分辨結(jié)構(gòu)方面的杰出貢獻(xiàn)。冷凍電子顯微鏡技術(shù)經(jīng)過近50年的持續(xù)發(fā)展，通過實(shí)驗(yàn)與計(jì)算方法的結(jié)合，在無需生物大分子結(jié)晶或標(biāo)記的天然生理狀態(tài)下，可以解析出生物大分子的原子分辨率三維結(jié)構(gòu)，因而超越X射線晶體學(xué)和核磁共振技術(shù)，成為生物大分子精細(xì)結(jié)構(gòu)解析中應(yīng)用最為廣泛的關(guān)鍵技術(shù)之一。

1 電子顯微鏡技術(shù)解析生物樣品所面臨的挑戰(zhàn)

早在Ernst Ruska（1986年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)得主）發(fā)明電子顯微鏡后不久，Marton便提出，由于電子束對生物細(xì)胞與細(xì)胞器的轟擊，利用這一新設(shè)備對生物樣品進(jìn)行研究時(shí)，必然會對樣品造成損傷。與此同時(shí)，為避免空氣分子對電子束的散射，電子顯微鏡工作時(shí)需抽成高真空，導(dǎo)致腔內(nèi)樣品中的水分難以保持，丟失大量結(jié)構(gòu)信息。因此，如何減小電子束對生物大分子樣品的輻射損傷以獲得其盡可能高分辨的結(jié)構(gòu)信息，成為了電子顯微鏡技術(shù)解析生物大分子結(jié)構(gòu)的一大難題。Marton提出構(gòu)想，利用冷凍或類似負(fù)染的樣品制備方法，提高樣品的抗電子輻射損傷的能力。

然而，利用冷凍電子顯微鏡研究生物大分子結(jié)構(gòu)時(shí)，生物樣品的制備和拍攝過程仍面臨許多困難。與X射線晶體衍射法相比，單顆粒冷凍電子顯微鏡技術(shù)最為顯著的優(yōu)勢在于不需要生物樣品結(jié)晶。但同時(shí)也對樣品的制備提出了其他要求，為得到不重疊的單顆粒圖像，生物樣品必須非常薄，理想情況下只有一個(gè)生物大分子層的厚度。在拍攝電鏡圖像的過程中，由于電子束的作用和熱運(yùn)動的影響，生物大分子通常會發(fā)生漂移，尤其是使用攝像模式不做修正地記錄圖像時(shí)，將導(dǎo)致圖像模糊，高分辨結(jié)構(gòu)信息丟失。此外，冷凍樣品中生物分子與水分子的化學(xué)組成元素相似，且成像時(shí)必須使用低電子劑量以減小電子輻射損傷，故圖像襯度和信噪比通常很低。獲得大量生物大分子的二維投影圖像后，根據(jù)構(gòu)象和歐拉角取向進(jìn)行準(zhǔn)確分類是單顆粒冷凍電子顯微鏡技術(shù)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)重建的核心問題。但是，原始單顆粒圖像的低信噪比對分類算法提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

2 冷凍電子顯微鏡樣品制備方法的突破

電子顯微鏡的生物樣品制備方法先后經(jīng)歷了負(fù)染到冷凍的發(fā)展過程。20世紀(jì)40年代，負(fù)染技術(shù)問世，并在其后的20年內(nèi)得到不斷地應(yīng)用和完善。負(fù)染操作是將生物材料嵌入重金屬鹽的非晶薄膜，在其周圍形成一層能夠抵御電子損傷的輪廓，且水分流失時(shí)不發(fā)生變化，所以能夠保持生物細(xì)胞或細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)信息。然而，通過負(fù)染制樣方法解析的生物大分子結(jié)構(gòu)分辨率低，因而應(yīng)用范圍受到限制，現(xiàn)在一般用來檢查樣品或建立初始模型，而高分辨結(jié)構(gòu)的解析有必要尋求更有效的制樣方法。

20世紀(jì)70年代中葉，Henderson和Unwin在制樣技術(shù)上邁出了新的一步。Henderson和合作者不對生物樣品染色，而是使用葡萄糖溶液代替水來保存樣品，并使用約1e－/?2的低劑量電子束將樣品的損傷降到最小，實(shí)現(xiàn)了室溫下對天然蛋白晶體的解析。通過這種制樣方法，Henderson和合作者得到了過氧化氫酶晶體和紫膜中細(xì)胞視紫紅質(zhì)二維晶體的投影圖像，并且旋轉(zhuǎn)樣品以獲取不同方向的投影圖像，建立了細(xì)胞視紫紅質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)密度圖，揭示了蛋白質(zhì)的一般結(jié)構(gòu)特征，但是這種方法只能解析到較低的分辨率。直到冷凍樣品制備技術(shù)成熟以后，Henderson等人繼續(xù)發(fā)展冷凍條件下的二維晶體電子成像和電子衍射方法，終于在1990年得到了近原子分辨的細(xì)胞視紫紅質(zhì)三維冷凍電子顯微鏡結(jié)構(gòu)。

1981年，Dubochet和McDowall系統(tǒng)地提出了非晶態(tài)冰冷凍的制樣方法。冷凍的制樣流程，首先將生物大分子的水溶液均勻地噴涂在銅網(wǎng)表面的碳膜上，而后迅速浸入約－170℃的液態(tài)乙烷（液氮降溫）中，生物大分子周圍形成一層非常薄的非晶態(tài)冰，可以提高樣品的抗電子能力，并保持水分不流失。Dubochet等人的研究還發(fā)現(xiàn)，非晶態(tài)冰在溫度低于－160℃的環(huán)境中不會發(fā)生結(jié)晶，為單顆粒冷凍樣品的穩(wěn)定保存奠定了基礎(chǔ)。

Dubochet和合作者提出的單顆粒冷凍制樣技術(shù)適用范圍十分廣泛，并且能夠在拍攝電子顯微鏡時(shí)保持生物中含量最多、占比最大的水分不流失，解決了自電子顯微鏡發(fā)明以來近50年未能克服的技術(shù)難題，因而從20世紀(jì)80年代該方法問世開始就迅速發(fā)展，現(xiàn)已成為冷凍電子顯微鏡單顆粒重構(gòu)與電子斷層成像技術(shù)中不可或缺的標(biāo)準(zhǔn)制樣方法。

3 冷凍電子顯微鏡單顆粒分析技術(shù)的開創(chuàng)

冷凍電子顯微鏡單顆粒重構(gòu)技術(shù)的數(shù)據(jù)處理包括：單顆粒圖像抽取、圖像分類、三維重建和高分辨密度圖精化。在數(shù)據(jù)處理算法的發(fā)展過程中，F(xiàn)rank和合作者做出了開創(chuàng)性的貢獻(xiàn)。20世紀(jì)70年代中期，F(xiàn)rank和合作者提出了基于互相關(guān)系數(shù)（cross-correlation）的電子顯微鏡單顆粒圖像分類算法。該算法的原理是計(jì)算單顆粒圖像之間的互相關(guān)系數(shù)，將相關(guān)性最高的歐拉角取向作為實(shí)際投影取向進(jìn)行分類平均。通過該算法的分析可以提高單顆粒圖像的信噪比，識別圖像的取向信息，并與Aaron Klug（1982年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主）提出的三維重建方法相結(jié)合，使生物大分子高分辨結(jié)構(gòu)的重建成為可能。然而，生物樣品通常具有異質(zhì)性，導(dǎo)致單顆粒投影并不來自于同一個(gè)三維構(gòu)象。1981年，F(xiàn)rank和van Heel提出了單顆粒圖像的聚類方法。這種基于K-means的分類算法將每張具有n×n個(gè)像素的圖像看作是n2維的數(shù)據(jù)，對應(yīng)于n2維超平面中的一個(gè)點(diǎn)，計(jì)算這些點(diǎn)之間的距離使最臨近的點(diǎn)聚為一類，最后對每一類中的圖像做平均得到低噪聲的單顆粒圖像。此后，F(xiàn)rank和Michael Radermacher在1986—1987年提出圓錐任意傾角方法（random conical tilt），van Heel在1987年提出公共線方法（common line），用于解析生物大分子的三維電子顯微鏡初始模型。Frank和他的同事們發(fā)展了單顆粒冷凍電子顯微鏡技術(shù)中重要的數(shù)學(xué)工具，奠定了生物樣品高分辨重建的基礎(chǔ)。值得一提的是，F(xiàn)rank和合作者在20世紀(jì)70年代就將這套數(shù)據(jù)處理算法實(shí)現(xiàn)為SPIDER軟件包，供其他研究者使用。

1998年，Sigworth提出了基于最大似然（Maximum Likelihood）的圖像排列算法。Scheres等人在Frank等人建立起來的冷凍電子顯微鏡圖像數(shù)據(jù)分析框架下，將最大似然算法拓展到單顆粒圖像的分類，并用于改進(jìn)電子顯微鏡三維密度圖的高分辨精化算法。在最大似然方法實(shí)現(xiàn)過程中，每一張圖像并不具有確定的取向，而是給出其在各個(gè)取向上的概率作為似然函數(shù)，通過優(yōu)化似然函數(shù)進(jìn)行圖像分類。該算法有效降低了電子顯微鏡圖像背景噪聲的影響，提高了分類準(zhǔn)確度，由Scheres開發(fā)成RELION程序，并迅速得到了廣泛的應(yīng)用。

4 冷凍電子顯微鏡技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀

自從20世紀(jì)90年代Henderson解析了細(xì)胞視紫紅質(zhì)的近原子分辨結(jié)構(gòu)、對單顆粒高分辨重建做了理論分析并指出需要克服的技術(shù)瓶頸以來，越來越多的生物大分子通過冷凍電子顯微鏡技術(shù)得到高分辨解析。2013年以來，由于直接電子探測器（direct electron detector）的應(yīng)用，冷凍電子顯微鏡三維重建的分辨率水平取得了重大突破。這種新型的電子探測裝置不僅可以記錄單電子（counting mode），得到很高的量子探測效率（detective quantum efficiency，DQE），而且響應(yīng)速度很快，可以在攝像模式（movie mode）下實(shí)時(shí)記錄生物樣品的變化，并由此對生物大分子的漂移做出修正。直接電子探測器和并行計(jì)算機(jī)等新技術(shù)在冷凍電子顯微鏡成像分析中的運(yùn)用，將單顆粒三維重建的分辨率提升到前所未有的精度，因而使單顆粒冷凍電子顯微鏡技術(shù)在生物大分子的結(jié)構(gòu)解析方面得到了非常廣泛的應(yīng)用。在小蛋白、超大復(fù)合體和膜蛋白方面，單顆粒冷凍電子顯微鏡都可以達(dá)到近原子分辨，典型的比如二十面體病毒顆粒，瞬態(tài)感受器電位陽離子通道子類V成員1（TRPV1）和G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）。少數(shù)情況下，該技術(shù)幾乎達(dá)到原子分辨，可與X-ray晶體衍射媲美，如1.8 ?的谷氨酸脫氫酶（GDH）。采用相位板的冷凍電子顯微鏡技術(shù)甚至將65 kD的血紅蛋白解析到了3.2 ?。與此同時(shí)，F(xiàn)rank及其合作者還將冷凍電子顯微鏡與機(jī)器學(xué)習(xí)相結(jié)合，用于還原生物大分子機(jī)器的低分辨能量景觀，為冷凍電子顯微鏡的未來應(yīng)用拓展提供了新的可能。

我國冷凍電子顯微鏡發(fā)展起步相對歐美較晚。其應(yīng)用自2015年以來卻趕上了由直接電子探測器推動的單顆粒冷凍電子顯微鏡的應(yīng)用熱潮，并取得了令人矚目的成果。應(yīng)用高分辨冷凍電子顯微鏡的代表性工作有剪切體、炎癥體、蛋白酶體和藻膽體等等。本課題組在國內(nèi)率先開展冷凍電子顯微鏡和人工智能的交叉領(lǐng)域的研究，將統(tǒng)計(jì)流形學(xué)習(xí)、聚類學(xué)習(xí)、深度學(xué)習(xí)等技術(shù)用于提升冷凍電子顯微鏡數(shù)據(jù)處理的算法性能、精度和效率，并開發(fā)成ROME軟件包，初步應(yīng)用于蛋白酶體全酶的動力學(xué)研究，為冷凍電子顯微鏡在未來實(shí)現(xiàn)生物大分子高分辨動力學(xué)分析打下了基礎(chǔ)。

5 總結(jié)與展望

Dubochet發(fā)展了用于冷凍電子顯微鏡樣品制備的一般方法，奠定了單顆粒冷凍電子顯微鏡的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；Frank提出了單顆粒重建和高分辨密度圖精化的一整套計(jì)算方法和技術(shù)框架，并通過軟件將之實(shí)現(xiàn)，奠定了單顆粒冷凍電子顯微鏡實(shí)現(xiàn)精細(xì)結(jié)構(gòu)解析的理論算法基礎(chǔ)；Henderson通過發(fā)展電子晶體學(xué)方法和對單顆粒三維重構(gòu)的理論分析，證明了冷凍電子顯微鏡技術(shù)解析生物大分子精細(xì)結(jié)構(gòu)的可行性，為冷凍電子顯微鏡技術(shù)發(fā)展指出了一條明路。Dubochet，F(xiàn)rank和Henderson的獲獎(jiǎng)不僅僅是對他們在冷凍電子顯微鏡方法學(xué)的開創(chuàng)性研究工作的表彰，更是對冷凍電子顯微鏡技術(shù)繼續(xù)蓬勃發(fā)展和在交叉學(xué)科中應(yīng)用的激勵(lì)。

在冷凍電子顯微鏡能夠?qū)⑸锎蠓肿拥撵o態(tài)結(jié)構(gòu)解析到原子分辨率的基礎(chǔ)上，物理學(xué)家們對生物大分子系統(tǒng)的動力學(xué)復(fù)雜性與熱力學(xué)統(tǒng)計(jì)性質(zhì)表現(xiàn)出極大的興趣。生命體內(nèi)的生物大分子并不是穩(wěn)定不變的，由于生物系統(tǒng)動力學(xué)或熱力學(xué)物理量的變化，生物大分子會表現(xiàn)出亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)象甚至連續(xù)構(gòu)象變化的非平衡態(tài)。與此同時(shí)，冷凍電子顯微鏡已經(jīng)初步具備了對生物大分子系綜中的每一個(gè)子系統(tǒng)進(jìn)行非平衡態(tài)解析的能力，因而將可能發(fā)展成為研究生物大分子能量景觀與非平衡統(tǒng)計(jì)性質(zhì)的最有力工具。生物大分子系綜的非平衡統(tǒng)計(jì)規(guī)律與其原位功能信息之間的關(guān)系，也將成為冷凍電子顯微鏡技術(shù)的下一階段的研究重點(diǎn)之一。這類研究最終將幫助我們認(rèn)識生命的能量本質(zhì)，揭示生物復(fù)雜性背后的基本規(guī)律。此外，冷凍電子顯微鏡還將在藥物設(shè)計(jì)、精準(zhǔn)分子醫(yī)療和軟物質(zhì)材料等影響人類生活質(zhì)量的重大應(yīng)用研究領(lǐng)域中發(fā)揮核心驅(qū)動作用。?