陰虛證、水腫證、陰虛水腫證中醫動物模型的造模方法及評價※

徐文峰范元碩何澤云唐 群彭亞軍李旭華

（1 湖南中醫藥大學第一附屬醫院腎臟內科，湖南 長沙 410000；2 湖南中醫藥大學研究生院，湖南 長沙 410000；3 湖南中醫藥大學醫學院，湖南 長沙 410000）

證候病理研究是中醫藥現代化研究的重要組成部分，中醫證候動物模型又是中醫藥研發和辨證論治機理研究的重要手段。動物模型的穩定性、可重復性是中醫藥現代化研究結果的真實性、可靠性、創新性的基本前提[1-2]。以腎內科常見臨床癥狀水腫為例，臨床常有水腫與傷陰并見之象，此陰虛水腫以發汗、利尿、健脾、溫腎等法難以奏效，水腫遷延難愈，目前有關陰虛水腫的理論探討、機理研究相對較少，有關動物模型報道亦少。本文旨在從模擬中醫病因的動物模型、模擬西醫病因病理的動物模型兩方面探討水腫、陰虛證動物模型造模現狀，總結陰虛水腫證動物模型的相對合理造模方式。

1 陰虛證動物模型

1.1 中醫病因病機造模方法

1.1.1 單因素造模

1.1.1.1 超負荷運動法 《本草經解》：“七傷者食傷、憂傷、飲傷、房室傷、饑傷、勞傷、經絡營衛氣傷之七傷也。七傷皆傷真陰”，過勞傷及真陰而致陰精耗損。吳柳花等[3]、汪泳濤等[4]將實驗大鼠在水深、水溫恒定環境下游泳6～8周，每周5天，每天1次，日游泳時間由10 min逐日增加至第五周末的120 min（或第7周末180 min），建立大鼠“陰虛內熱證”模型。此法在病因上更接近臨床。

1.1.1.2 長期激怒法 《素問·陰陽應象大論》曰：“暴怒傷陰”。刺激實驗動物使其長期處于躁怒狀態，模擬因情志失調，肝郁化火，久而傷陰以建造肝腎陰虛型動物模型。俸道榮等[5]將雄性SD大鼠雙后肢束縛，成對倒吊于籠內，激怒實驗大鼠，使其粗叫、嘶咬等，首次激怒20 min，以后每隔1天，增加激怒時間10 min，直至激怒時間達到40 min。隨著天數增加，實驗動物出現活動減少，具體表現為扎堆、倦臥、嗜睡等，同時表現出拱背、胡須下垂、叫聲細、毛無光澤、大便干燥、易激怒等，認為動物已處于“暴怒傷肝”“暴怒傷陰”狀態。

1.1.1.3 藥物損傷法 根據中醫陰陽學說“陰陽對立”理論，以附子、干姜、肉桂等辛溫燥烈之陽藥，因“陽勝則陰病”“火熱灼津，營陰暗耗”而使實驗動物陰液虧虛，造成陰虛模型。韓冰冰等[6]以制附片、干姜、肉桂等復合煎劑灌胃14天建立陰虛內熱大鼠模型。此法操作簡便，過程易量化控制，模型“內熱”及“內燥”表現明顯，虛熱證陰虛內熱的分子機制可能與刺激應答相關基因及固醇代謝相關基因兩類基因的異常表達相關。

1.1.1.4 逐水傷陰法 中醫認為“水火者，陰陽之征兆也”，通過對實驗動物減少水入，增加排出，使其處于“缺水”狀態，造成津虧內燥傷陰，表現陰虛內熱的證候。馮志毅等[7]在家兔禁食禁水18 h后由耳緣靜脈注射呋塞米注射液，1 h后同法注入等量呋塞米注射液，再過1 h后由耳緣靜脈注射大腸桿菌造模。造模后家兔出現煩躁、氣促、大便干燥、耳廓發紅發熱、舌紅少津、體溫升高等陰虛癥狀相似表現。但此模型穩定性差，脫水癥狀糾正后，諸癥改善，與中醫“陰虛難復”的臨床表現不符。

1.1.1.5 高鹽飲食法 《黃帝內經》篇云：“夫鹽之味咸，其氣令津泄”“咸走血，咸者腎之味”。中醫五行學說認為：腎在味主咸，高鹽飲食的持久攝入，可耗液傷津，使實驗動物出現血壓升高、躁動、大便干燥等陰虛陽亢表現。姜麗芳等[8]予Wistar大鼠高鹽飼料 (含食鹽9%)，同時飲用水初始予自來水，30 d后改為0.9%鹽水，共喂飼150 d造模。造模后測量大鼠清醒安靜狀態時的尾動脈血壓，模型組明顯高于正常飲食組，綜合大鼠癥狀表現，考慮其為“高血壓陰虛陽亢證”模型。

1.1.2 多因素復合造模

1.1.2.1 特殊環境法 凌昌全等[9]將大鼠置于人工氣候室內（干球40℃、濕球32℃）進行熱應激3 h處理，大鼠表現為昏睡，耳、爪、尾等潮紅，大量流涎，氣促等，考慮可將其視為“熱損傷陰證模型”。此法僅通過大鼠表象的變化進行評述造模結果，缺乏客觀檢測指標數據支持，故造模準確性有待商榷。

1.1.2.2 番瀉葉結合運動法 易杰等[10]選取雌/雄SD大鼠，飲食上予給番瀉葉致瀉，同時加以游泳運動，造模1月。實驗大鼠出現消瘦、倦怠、大便稀等表現，考慮為“脾陰虛證”模型。

1.1.3 中醫病因病機造模方法的評價 中醫病因病機造模法，是以中醫證候為觀測指標，中醫病因病機理論為操作指導，通過非藥物等干預，研制臨床動物模型的方法。所研制模型具有貼近中醫病因現實的優勢，與中醫證候表現吻合度高。但因為中醫病因病機概念的不確定性、證候與病因間因果關系的多元性，以及造模實驗動物與人體間物種的差異性、實驗動物的個體差異性，使該大類下所造模型可量化數據缺乏，造模過程中操作人員主觀意識對實驗過程影響較大，成功率、穩定性較低，可重復性差，有待進一步研究、解決。

1.2 西醫病因病理造模方法

1.2.1 甲狀腺激素類造模法 此法通過實驗動物攝入甲狀腺激素類藥物[甲狀腺片、三碘甲腺原氨酸（T3）和左旋甲狀腺素鈉（T4）]，模擬甲狀腺功能亢進癥狀，出現怕熱、多汗、神經過敏、急躁、震顫、心率加快、心輸出量增加等類似于陰虛的現象。李慧芬等[11]取雄性SD大鼠，適應性喂養3天后稱定質量，每天灌服20 mg/kg甲狀腺片 (以甲狀腺素計)誘導腎陰虛模型，連續24 d。造模后實驗大鼠逐漸出現毛發疏松，粗糙無光澤，精神萎靡，拱背少動，納食減少，體質量下降等體征，考慮“腎陰虛”模型造模成功；毛連根等[12]對大鼠每天腹腔注射5%T3(0.2 mL/100 g)連續多日制備“陰虛”模型。

1.2.2 腎上腺皮質類激素法 此法通過讓實驗動物被攝入氫化可的松、地塞米松等糖皮質激素，模擬臨床使用腎上腺皮質類激素后出現的副反應建立“陰虛”動物模型。戴冰等[13]對KM小鼠先予以每天0.02 mL/g蒸餾水灌胃，連續6 d，第7～10天，按50 mg/kg給予氫化可的松灌胃，自由飲水、飲食，造模共持續10 d，造模后小鼠出現煩躁、易激惹、拱背扎堆、毛發枯槁、易脫落、大便干結、飲食增多等陰虛癥狀。

1.2.3 甲狀腺素類聯合利血平造模法 此法與甲狀腺激素類造模法類似，通過讓實驗動物攝入甲狀腺激素類藥物[甲狀腺片、三碘甲腺原氨酸（T3）和左旋甲狀腺素鈉（T4）]和利血平模擬甲狀腺功能亢進癥狀。鄔林祥等[14]將昆明雌性小鼠體質量（30±29） g，以利血平15 μg/只+甲狀腺素25 μg/只，灌胃，1次/d，連續7 d；實驗小鼠出現進食減少，飲水增多，體重減輕，躁動不安，易驚，后期出現視力障礙等，確定造模成功。

1.2.4 手術法 廖圣寶等[15]將實驗大鼠經腹膜后近主動脈側分離左腎動脈，以0.2 mm銀莢狹窄左腎動脈，常規飼養1周后，測實驗大鼠尾動脈收縮壓較術前升高22.6 mmHg以上，且超過135 mmHg者，為陰虛證造模成功 (二腎一夾高血壓)。

1.3 西醫病因病理造模方法的評價 陰虛證西醫病因病理造模法是通過現代醫學干預手段，使實驗動物出現固定方向機體損傷，進而表現中醫陰虛證候表現，操作簡便，造模數據客觀，可重復性高，且根據中醫理論，予相應藥物反證模型成立。但中醫證候與西醫臨床診斷關系是非充分必要性的，是不可逆的。采用西醫病因病理造模的動物模型在理論方面與中醫傳統理論脫節，單純的理化、生物損傷因素使模型對中醫證候的表達局限化、片面化。因此西醫病因病機理論指導下研制的動物模型，適合特定情況下中醫證候及治療的研究，如甲狀腺功能亢進患者表現為陰虛證時的生化、治療的研究，但用于單純中醫證候方面的實驗研究，易造成實驗數據片面，大數據真實性降低。

2 水腫證動物模型

中醫認為水腫是由外感、內傷等多種因素造成肺脾腎三臟對水液宣化輸布功能失調，致使體內水液潴留，外溢于肌表引起，臨床常見于風水泛濫、濕毒浸淫、氣滯水停、脾陽虛衰、氣陰兩虛等證候[16]，查閱近10年文獻，單純依靠中醫理論指導，難以短期內復制出適用的水腫實驗動物模型。西醫病因病理指導下的模型研制，具有簡便、高效、重復性高等優勢，故水腫模型多采用西醫造模方法。目前常用造模方法為阿霉素法，即通過讓實驗動物攝入一定量的阿霉素，引起全身性水腫。周寧等[17]將大鼠適應性喂養1周后尾靜脈注射阿霉素，首次劑量為4 mg/kg，8天后再次尾靜脈注射阿霉素3.5 mg/kg。造模后模型大鼠的血肌酐、尿素氮和尿蛋白水平較正常組顯著升高，同時出現低蛋白血癥，提示造模后大鼠腎功能受損伴水腫癥狀。

此法簡便、可行，成功率高，實驗數據量化程度高，可重復性好。但阿霉素對實驗動物的影響是非特異性的，對實驗動物造成的損傷亦是多方面的，如臨床亦有用阿霉素法研制心源性水腫動物模型的報道[18]，故現實應用中，應盡量加強對可變因素的控制，同時綜合考慮諸因素間相關性。

3 陰虛水腫證造模方法

目前常用造模方法是阿霉素聯合甲狀腺激素類方法，此方法通過復合藥物刺激，使實驗動物同時具有水腫和陰虛的表現。王洪玉[19]將大鼠適應性喂養3 d后，每日按照15 mg/100 g體重給予甲狀腺素混懸溶液灌胃，自由飲水、飲食，連續21 d。第一天按照4 mg/kg體重首次尾靜脈注射阿霉素溶液，7 d后同樣的方法按照3.5 mg/kg體重第2次注射，注射5 d后檢測24 h尿蛋白陽性為模型成功的標志。

陰虛水腫證動物模型，是病證結合動物模型的一種，此類模型是確定方向下中醫證候動物模型，具有（1）貼近中醫證候特點；（2）穩定性、可靠性及可重復性強，以西醫疾病模型為基礎，造模結果數據化高，彌補了中醫傳統病因致病的模糊性、非特異性及不可控性缺點；（3）臨床實際應用性強等優勢。是特定方向中醫證候研究的理想化模型。將中醫很多“證”的不確定因素由于“病”的限制變得更加清晰，可廣泛適用于疾病中醫證候現代本質的研究、中西醫綜合治療研究等，能更精確地闡明中醫證的本質。但此類模型的不足也十分明確，無法準確反映中醫理論下疾病的發生發展過程。

4 總結

陰虛水腫證因其臨床病例較少、治療難度大、治療經驗記載有限等特點，因此陰虛水腫證動物模型的建立，成為臨床研究中的重要部分。在現有三大模型建立思路下，以中醫病因病機為指導的造模方法，動物模型更接近臨床證候，但受中醫病因的不確定性、證候表現的主觀性大、動物與人物種的差異性、實驗個體的差異性等影響，使模型穩定性、量化性差，可重復性低，不利于大范圍臨床試驗和數據化分析；以西醫病因病理為指導的造模方法，雖穩定性、可重復性、造模數據量化性高，短時間內大量穩定復制，但基于中醫證候與西醫臨床表現間非必要充分關系，使模型難于完整表現中醫證候，不利于中醫證候的全面性研究；基于中西醫雙重理論基礎指導下的病證結合動物模型，兼具現代動物模型穩定性高、可重復性高等試驗要求，同時具有中醫證候的癥狀體征表現，雖模型具有特定指向條件下中醫證候表現的特征，且無法反映中醫理論下疾病的發生發展等病理過程、病證傳變等，但與現階段中醫證候臨床研究思路契合度高，是現階段中醫證候試驗動物模型造模方法的不二選擇。