基于高通量測序的郫縣豆瓣不同發酵期細菌群落結構及其動態演替

關統偉，向慧平，王鵬昊，鄧奧宇，董 丹，趙順先，張習超

（西華大學微生物研究所，食品生物技術四川省高校重點實驗室，四川 成都 610039）

郫縣年均氣溫15.7 ℃，相對濕度70%，氣候溫和，冬無嚴寒，夏無酷暑，無霜期長。這些環境因素為郫縣豆瓣微生物菌群的生存提供了最佳環境，協同優質的蠶豆和二荊條辣椒，憑借300多年的開放式傳統釀造技藝，共同造就了郫縣豆瓣獨特的風味與營養和不可復制的產品特點，也是國家地理標志產品。國內報道了一些關于郫縣豆瓣細菌類群的研究，大多為純培養研究，發現了一些有價值的細菌類群，如乳酸菌、芽孢桿菌等[1-4]。由于純培養的局限性，一些非培養技術被運用到郫縣豆瓣細菌類群的研究中。張琦等[5]運用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳技術研究了郫縣豆瓣自然發酵過程中細菌群落結構的變化；趙紅宇等[6]利用高通量測序技術對郫縣豆瓣對發酵過程中細菌群落結構的變化。鑒于開放式的傳統發酵工藝中環境的復雜性、污染的不可控性以及產品風味的不穩定性因素，本研究利用高通量測序技術系統全面地研究郫縣豆瓣整個發酵期不同階段的細菌群落及其動態演替規律，以確定不同發酵期細菌優勢群體及其可能的污染細菌，為開發郫縣豆瓣專用細菌菌劑，保障產品風味質量的穩定性以及安全性提供理論參考和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗共采集了郫縣豆瓣6 個發酵時期的樣本，豆瓣樣本編號分別為：BZ1Y、BZ5Y、BZ10Y、peijiao、HE1Y和HE5Y。樣品采集使用多點取樣法，通過在發酵池的兩端以及中間3 個位置分別取上、中、下層等量豆瓣樣品，混合均勻備用。6 個時期的樣本信息分別為編號BZ1Y、BZ5Y和BZ10Y 3 個樣本分別在甜瓣子發酵的第1個月、第5個月和第10個月采樣；編號peijiao取樣至發酵3 個月的成熟新鮮辣椒醅；編號HE1Y和HE5Y是將發酵10 個月的甜瓣子（BZ10Y）和發酵3 個月的辣椒醅（peijiao）混勻后的發酵階段，混合發酵時間分別為1 個月和5 個月。

TaqDNA polymerase、dNTPs、DL2000TMDNA Marker 大連寶生物工程有限公司；蛋白酶K 德國Merck公司；溶菌酶 美國Sigma公司；N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺、去離子甲酰胺 美國Solarbio公司。

1.2 儀器與設備

5430高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；My Cycler型聚合酶鏈式反應儀 美國Bio-Rad公司；Bio-Best 200E型凝膠成像分析系統 美國西蒙公司；臺式冷凍離心機 德國Eppendorf公司；MX-S型可調式混勻儀美國賽洛捷克公司；核酸蛋白微量檢測儀 美國MD SpectraMax Drop公司；MiSeq測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品總DNA提取及其高通量測序

采用倪崢飛等[7]的液氮研磨＋溶菌酶＋十二烷基硫酸鈉高鹽抽提法提取郫縣豆瓣中的細菌總宏基因組，然用核酸蛋白儀檢測DNA的濃度和純度。高通量測序文庫的構建和基于Illumina MiSeq平臺的測序由金唯智生物科技（北京）有限公司完成。V3-V4可變區采用的測序引物是“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”和“GGACTACNVGGGTWTCTAATCC”；同時V4-V可變5區采用的測序引物是“GTGYCAGCMGCCGCGGTAA”和“CTTGTGCGGKCCCCCGYCAATTC”。最終得到的序列用于OTU分析，使用VSEARCH進行序列聚類（序列相似性設為97%），用RDP classifier（核酸數據庫，Ribosomal Database Program，RDP）貝葉斯算法[8]對OTU的代表性序列進行物種分類學分析。基于OTU的分析結果，采用對樣本序列進行隨機抽樣的方法，分別計算Shannon、Chao1等Alpha多樣性指數，并作出稀釋曲線。通過Unweighted UniFrac分析比較樣本間是否有顯著的微生物群落差異，基于Unweighted UniFrac樣本間距離矩陣用于主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）可視化2D圖展示Beta多樣性等。

1.3.2 樣品序列的提交及序列注冊號獲取

通過ENA的FTP服務器，將郫縣豆瓣不同發酵時期的樣品高通量測序所得fastq序列文件提交到了ENASRA數據庫（http://www.ebi.ac.uk/ena/submit），獲得其接受號為PRJEB17866。

2 結果與分析

2.1 測序數據統計與OTU分析

按照條形碼標簽完全匹配方式提取測序序列，高通量測序中通常會出現一些點突變等測序錯誤，而且序列末端的質量比較低，為了得到更高質量及更準確的生物信息分析結果，需要對測序原始數據進行優化處理。優化處理軟件選用Trimmomatic（v0.30 http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic）。將上面過濾后的序列與數據庫進行比對，去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數據，如表1所示。通過郫縣豆瓣不同發酵時期各樣品中細菌的16S rRNA基因測序，6 個樣品總計測得原始序列條數為1 543 610 條，過濾掉低質量的序列后，總數為1 507 972 條。在上述序列進行去冗余處理后，有效序列數731 188 條，并在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的OTU，共產生37 082 個，統計得到所有樣品在不同OTU中的豐度信息，各樣品測序信息結果如表1所示。peijiao樣品中的OTU最多，達到了23 362 個，HE5Y樣品中的OTU最少，僅為1 847 個。

表1 不同發酵時期郫縣豆瓣樣本的測序數據統計Table1 Statistics of bacterial genomic sequence data for Pixian bean paste samples from different fermentation stages

稀釋曲線反映了測序的深度，也可以用來評價測序量是否足以覆蓋樣品所有種群。從圖1可知，5個樣品（BZ1Y、BZ5Y、BZ10Y、HE1Y和HE5Y）稀釋曲線均基本趨于平緩，說明所得序列可基本反映真實環境中細菌群落結構；但樣品peijiao呈現一種上升的趨勢，很大程度上未達到飽和，說明表明繼續測序還可能產生新的OTU。

圖1 不同發酵時期郫縣豆瓣細菌稀有度曲線Fig. 1 Rarefaction curves for bacterial communities in Pixian bean paste samples from different fermentation stages

2.2 樣品間Alpha多樣性分析

表2 樣品間Alpha多樣性統計Table2 Alpha diversity of bacterial communities at different fermentation stages

采用Alpha多樣性指標中的ACE指數、Shannon指數和Chao1指數對樣品序列文庫的OUT數目、群落的異質性以及估計群落中物種總數。由表2可以看出，郫縣豆瓣不同發酵時期細菌Shannon指數從最初的4.77到發酵結束的4.48，其變化不大，表明樣品中群落種群差異性相對較小，但在peijiao發酵期，該指數顯著增高，說明該時期的細菌種群差異大。而OTU數、Chao1和ACE指數均明顯低于發酵初期（BZ1Y）樣品，則表明隨著發酵的深入和環境的不斷變化，樣品中細菌群落的種群多樣性和總體豐度不斷降低。

2.3 樣品間Beta多樣性分析

Beta多樣性指沿環境梯度不同生境群落之間物種組成的相異性或物種沿環境梯度的更替速率也被稱為生境間的多樣性。不同群落或某環境梯度上不同點之間的共有種越少，Beta多樣性就越大。群落生態學中，Beta多樣性主要描述物種組成在時空尺度上的變化。Beta多樣性分析可通過多變量統計學方法PCoA實現，直觀顯示不同環境樣品中微生物進化上的相似性及差異性。

圖2 樣本間細菌群落PCAFig. 2 PCA results of microbial communities from Pixian bean paste

主成分分析（principal component analysis，PCA）表明（圖2），PC1和PC2分別在樣品差異性貢獻率上達到72.17%和17.71%，合計達到89.88%，是差異的主要來源。PCA樣品BZ1Y、BZ5Y和BZ10Y距離最近，均位于PC2的正值區域，說明三者細菌群落的相似度較高；其次HE1Y與HE5Y相近性次之，樣品HE1Y與HE5Y分別處于均位于PC2的負值區域，分別位于PC1坐標軸正側，較為靠近的位置，說明兩樣品間的主成分變異不顯著；PCA可以看出，5 個樣品與peijiao樣品的距離較遠，細菌群落組相似度較低。總體而言，不同發酵環境及其周期的不同，也顯示出樣品中細菌群落的分布顯著變化。

2.4 樣品間門水平的細菌群落結構分析

采用RDP classifier對各樣品中的OTU依次進行門、綱、目、科、屬的分類信息分析，一共獲得11 個門的細菌和一些無法歸類的細菌（圖3）。這些門分別為Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Chlorobi、Chloroflexi、Gemmatimonadetes、Fusobacteria、Cyanobacteria、Bacteroidetes、Acidobacteria和Deferribacteres。在甜瓣子發酵時期（BZ1Y、BZ5Y和BZ10Y）與辣椒瓣子混合發酵階段（HE1Y與HE5Y）Firmicutes是優勢種群，占到各時期細菌種群的50.7%～90.9%；而在辣椒醅發酵階段（peijiao）Firmicutes僅占該時期細菌種群的4.2%，而Proteobacteria和Cyanobacteria中的細菌成為peijiao時期發酵的優勢群體，分別占全部細菌總數的70.4%和24%。另外，BZ1Y序列分析表明數量較多的細菌群體分別是Firmicutes（80.5%）、Proteobacteria（8.1%）和Actinobacteria（10%）；BZ5Y的優勢細菌種群是Firmicutes（86.5%）、Proteobacteria（3%）和Actinobacteria（9.7%）；發酵10 個月后，優勢群體的種類沒有改變，但數量已經發生了變化，BZ10Y中的優勢細菌Firmicutes、Proteobacteria和Actinobacteria的含量分別變化為90.9%、5.4%和2.7%。由于辣椒醅混入豆瓣發酵，帶入了新的細菌類群，因此在混合1個月發酵（HE1Y）后優勢細菌成為Firmicutes（52.7%）、Cyanobacteria（10.6%）、Proteobacteria（30.7%）和Actinobacteria（5.7%）；混合發酵豆瓣成熟后（HE5Y）優勢細菌為Firmicutes（70.7%）、Cyanobacteria（17.1%）、Proteobacteria（6.4%）和Actinobacteria（5.5%）。說明郫縣豆瓣整個發酵過程中，細菌種群始終處于動態的變化當中。

圖3 門水平各樣本菌群分布圖Fig. 3 Phylum frequencies of microbial communities from samples

2.5 樣品間屬水平的細菌群落分布

通過高通量測序，郫縣豆瓣整個發酵過程中共有185 個屬的細菌和部分未能分類的細菌被挖掘。屬水平的細菌群落數量在前50的屬熱圖分析（圖4）表明，測序結果中組成比例較高的前50 個屬分別是Hafnia、Methylobacterium、Paracoccus、Chromohalobacter、Halanaerobium、Halomonas、Ochrobactrum、Rhizobium、Rahnella、Wohlfahrtiimonas、Pectobacterium、Tatumella、Empedobacter、Klebsiella、Myroides、Acinetobacter、Stenotrophomonas、Serratia、Lampropedia、Alcaligenes、Brachybacterium、Leucobacter、Providencia、Brevibacterium、Ignatzschineria、Enterococcus、Arthrobacter、Lactococcus、Jeotgalicoccus、Kurthia、Proteus、Morganella、Paenochrobactrum、Lentibacillus、Oceanobacillus、Gracilibacillus、Virgibacillus、Staphylococcus、Pantoea、Enterobacter、Pseudomonas、Brenneria、Leuconostoc、Vagococcus、Weissella、Tetragenococcus、Lactobacillus、Pediococcus、Corynebacterium和Bacillus。熱圖分析表明了郫縣豆瓣不同發酵時期樣品間不同細菌屬的相對豐度以及細菌組成的差異性和和樣品間的相似性。如熱圖中的BZ1Y樣品中檢測到38 個屬，BZ5Y中37 個屬，BZ10Y中36 個屬；單獨發酵成熟的peijiao樣品中檢測到44 個屬，由于辣椒醅的混入，瓣子與辣椒醅的混合發酵HE1Y樣品中有47 個屬，隨著混合發酵的繼續進行，在成品豆瓣HE5Y樣品中獲得42 個屬。樣品間屬水平的聚類關系（圖4）可以看出BZ1Y、BZ5Y和BZ10Y聚在一起，表明3個樣品的相似度較高；HE1Y與HE5Y的相似度也較高，而peijiao樣品形成了一個獨立的分支，說明peijiao與其他5 個樣品的相似度較低，與其他5 個樣品的細菌組成差異較大。這個結果也符合郫縣豆瓣的實際發酵情況，因為peijiao樣品是單獨發酵的，與甜瓣子的發酵環境、材料等差異較大。

圖4 不同樣品間的細菌熱圖Fig. 4 Heat map of bacteria in different samples

圖5 各樣品在屬水平的細菌群落結構組成差異Fig. 5 Bacterial community structures of all the samples at the genus level

圖5 反映了不同樣品間屬水平細菌（前50）群落組成的變化情況。在瓣子發酵初期（BZ1Y）的主要優勢細菌為Staphylococcus（65.31%）、Corynebacterium（3.45%）、Brevibacterium（3.75%）、Ignatzschineria（2.46%）、Lactobacillus（2.26%）和Pediococcus（2.24%）。隨著發酵的進行Staphylococcus的含量逐漸上升，Corynebacterium數量先上升后下降，Brevibacterium的含量呈現下降的趨勢。在瓣子發酵的中期（BZ5Y）的主要細菌為Staphylococcus（74.07%）、Corynebacterium（6.99%）、Bacillus（4.24%）和Weissella（2.49%），Bacillus和Weissella的細菌出現大幅增長。同時，也存在著多種新物種的出現和初始物種的消失，如Jeotgalicoccus是瓣子發酵初期的原始物種，而到了發酵后期未被檢測到。Brenneria和Methylobacterium出現在瓣子發酵的中期，但在發酵初期和發酵后期均未檢測到；而Halomonas和Paracoccus也出現在瓣子發酵中期，隨后一直存伴隨于瓣子的發酵過程。到了瓣子發酵的末期（BZ10Y），優勢菌群為Staphylococcus（79.93%）、Pediococcus（3.28%）、Lactobacillus（3.22%）、Corynebacterium（2%）和Weissella（2%）。此時，同步單獨發酵的辣椒醅（peijiao）成品中的優勢細菌為Pantoea（13.08%）、Pseudomonas（2.32%）、Enterobacter（2.26%）和Brenneria（2.16%），并且有高達44.72%的物種未歸類，這些物種可能存在一些新的物種信息，值得深入研究。在辣椒醅與瓣子混合的初期HE1Y中優勢菌為Staphylococcus（25.26%）、Weissella（11.51%）、Tetragenococcus（5.57%）、Pantoea（5.35）和Corynebacterium（3.78%）；到了發酵末期，成熟豆瓣HE5Y中的優勢細菌變為Staphylococcus（43.81%）、Tetragenococcus（6.81%）、Weissella（4.89%）、Corynebacterium（3.41%）和Lactobacillus（3.09%）。因此，郫縣豆瓣的發酵過程中伴隨著優勢種群的數量和種類的動態變化，同時也影響著產品的質量與風味。

3 討 論

目前，已經發現的純培養微生物還不到自然界微生物總量的1%[9]，因此，利用傳統分離技術全面揭示樣品中的微生物組成幾乎不可能。宏基因組學于1998年提出[10]，隨后高通量測序技術的出現不僅使得環境微生物被全貌解析成為可能[11]；近年來，高通量測序技術也廣泛的應用于水環境、陸地、腸道、動植物等環境微生物檢測[12-18]，而且在在環境監測、生產管理、微生物疾病控制和生態評估等方面發揮著重要意義[19-21]。

高通量測序技術的快速發展對食品微生物發酵過程和機制研究產生了深刻的影響，對食品發酵工程優化提供了很好的數據支撐[22-26]。郫縣豆瓣作為我國著名的傳統發酵食品，開放式的半固態發酵體系和適宜的郫縣氣候條件高效的網羅了大量環境細菌參與豆瓣釀造。這些環境中的細菌，隨著發酵時間的推移而發生著顯著的動態變化。同時，悠久的釀造歷史也使得一些細菌在高鹽濃度條件下逐漸適應，并成為郫縣豆瓣中的優勢種群，為郫縣豆瓣風味和質量的穩定性保駕護航。本研究完成了郫縣豆瓣全發酵過程的細菌高通量測序，結果表明伴隨于整個郫縣豆瓣發酵的優勢細菌屬為：Staphylococcus、Weissella、Pediococcus、Lactobacillus、Corynebacterium和Bacillus，它們在數量上隨發酵時間有所變化，但相對比較穩定；毫無疑問，它們對郫縣豆瓣的質量與風味產生重要的影響。這些研究成果也為未來開發郫縣豆瓣專用細菌菌劑提供了很好的參考價值。張琦等[5]采用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳對郫縣豆瓣細菌的研究發現Staphylococcus xylosus是整個發酵過程中的優勢細菌，本研究中Staphylococcus中的細菌數量（25%～80%）也在整個發酵過程中占據絕對優勢。通常Staphylococcus中的金黃色葡萄球菌為致病菌，表皮葡萄球菌中有部分是致病菌，S. xylosus是弱致病性的，而腐生葡萄球菌是不致病的。葡萄球菌屬的細菌部分具有耐鹽性，生長營養需求不高，可能將導致豆瓣醬成品質量檢測不合格。Staphylococcus在郫縣豆瓣發酵過程中具體起著有益的還是有害的作用都需進一步深入探索。因此，在生產中需要多加關注Staphylococcus菌群的生產控制，在未來研發中要闡明此類菌群的功能性。Bacillus也是郫縣豆瓣的優勢種群，這與筆者前期的純培養結果[1,3,27]以及趙紅宇等[6]的實驗結果基本一致。另外，首次發現Pediococcus和Corynebacterium作為郫縣豆瓣發酵過程的優勢菌。據研究[28-30]Pediococcus在釀酒環境中經常被發現該菌在豆瓣中的功能還需要進一步探索，以便于更好地為郫縣豆瓣產業的規模化和現代化服務。

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