紅細胞血型基因分型在精準輸血醫學中的應用

(Tongmao ZHAO)

(美國國立衛生研究院(National Institutes of Health，USA)，20892)

1900年人類ABO血型的發現開創了免疫血液學(Immunohematology)，它成為現代輸血醫學的基礎之一。在20世紀前半期，免疫血液學主要采用免疫血清學、生物化學以及經典遺傳學等方法，檢測紅細胞表面的血型抗原和抗體。 20世紀90年代，隨著分子生物學技術擴展到整個生物醫學研究領域，分子免疫血液學 (Molecular Immunohematology) 應運而生，它主要研究血型抗原和基因多態性的分子基礎。21世紀初生物醫學領域進入了后基因組時代，相應產生了一門新的血型基因組學 (Blood Group Genomics) 學科，并建立了以DNA為基礎的血型基因分型技術，它在精準輸血醫學(precision transfusion medicine)中扮演著重要角色。本文主要論述了血型基因分型在實際應用中的一些最新研究進展。

1 紅細胞血型抗原和基因

截止2017年被國際輸血協會(ISBT)認可的總數為346個，其中308個分屬36個血型系統，其余38個抗原尚未被歸類。幾乎所有具有臨床意義的血型系統的分子基礎已被闡明[1]。根據美國國家生物技術中心(NCBI)的血型基因突變數據庫(Blood Group antigen gene Mutation Database，BGMUT)統計，目前已經檢測出45個血型基因，含有1 800多個等位基因[2]。已闡明的血型遺傳多態性產生機制包括單核苷酸取代(SNP)、基因缺失或插入、基因不等交換、剪接位點突變、基因重組和雜交基因等[3]。

2 精準醫學時代的分子免疫血液學

精準醫學的基本概念是考慮到個體差異后所實施的預防診斷和治療策略，2011年美國科學院即提出要走向精準醫學、建立生物醫學研究的知識網絡和新的疾病分類學。美國奧巴馬總統在2015年的國情咨文中呼吁以精準醫學方法改善醫療服務。美國國立衛生研究院(NIH)現任院長COLLINS在“精準醫學新舉措”一文中提出，輸血中的血液分型是精準醫學的首例應用之一[4]。2015年9月10日在NIH舉辦了“2015年精準醫學紅細胞基因分型”研討會，討論了分子免疫血液學的進展和如何改變對患者的護理，通過病例報告說明患者護理策略；回顧了分子分型基礎研究及其在臨床實踐中意義；探討了紅細胞基因分型防止同種免疫的策略以及紅細胞基因分型在精準輸血醫學中的未來發展[5]。

目前分子免疫血液學檢測在全球變得越來越普遍，血型工作者都認可任何單獨血型血清學方法都不能滿足臨床輸血的實際需要，唯有結合更個性化的基因檢測方法才能使患者受益。基因分型作為輔助技術有助提高紅細胞定型準確性，而且可以檢測血清學方法無法鑒定的血型基因多態性。2015年美國血庫協會(AABB)分子免疫血液學圓桌會議討論了在血型檢測領域具有挑戰性和爭議性的一些議題，會議認為雖然血清學仍然是在緊急情況下的唯一實用方法，但是分子檢測是解決復雜問題的黃金標準，包括血型抗原的疑似變異體、表型被最近輸血掩蓋、直接抗球蛋白試驗陽性的樣品等。會議預期如果分子技術變得更簡便易行、檢測時間更快、費用更低，那么將來某些血型系統的基因分型可能會替代血清學分型[6]。

在血型基因檢測技術興起的同時，美國AABB于2008年率先推出“紅細胞、血小板、中性粒細胞抗原分子檢測標準”，在2016年已經更新到第3版[7]。此外，AABB還舉辦一系列研討會，為這日益成熟技術的應用提供了深入探討的平臺，發揮監管和倡導作用，為創新鋪平道路，并通過其教育措施和出版物來傳播尖端研究結果。美國食品藥品監督管理局(FDA)生物制品評估和研究中心(CBER)，作為評估和驗證機構也開始為紅細胞基因分型制定相關法規，制備用于評估基因分型技術和試劑的DNA參考品[8]。參考品將包括AABB推薦的約90種血型基因型，捐贈者紅細胞將冷凍保存用于血清學分型，同時通過EB病毒轉化來建立淋巴母細胞樣細胞株，通過細胞培養制備的基因組DNA也將通過國際合作等形式得到確認。由于血型分布與人種以及種族群體相關，中國也在建立適合本國人群的血型基因標準DNA配組[9]。

3 血型基因分型用于檢測患者血型

3.1 直接抗球蛋白試驗陽性和紅細胞多凝集作用患者

患者紅細胞與IgG抗體結合，在直接抗球蛋白試驗中呈陽性反應。雖然采用諸如二磷酸氯喹或EDTA-甘氨酸(EGA)處理紅細胞的方法可以去除IgG，但并非總是成功的。具有多凝集作用紅細胞的血型鑒定，通常都會遇到麻煩，在這些情況下基因分型可以預測患者紅細胞表型。

3.2 最近輸血患者

對于最近輸血的患者，獲得準確的表型有時是不可能完成的任務。嘗試將輸入的供者紅細胞與患者紅細胞分開通常不會成功，因此患者最可能的表型一般是通過最佳猜測方法得出。但是DNA分型可以用來準確預測患者的表型，而且輸入的供體白細胞不影響分型結果。

3.3 鑒定ABO血型疑難樣品

這些樣品包括ABO血型正反定型結果矛盾，ABO不匹配的造血干細胞移植、大量輸注外來血液、冷自身抗體、急性骨髓性白血病以及免疫缺陷病導致ABO抗原性減弱等。所有這些定型疑難樣品，都可以通過基因分型解決。參加2015年AABB分子免疫血液學圓桌會議的34%(18/53)與會者表示曾利用基因分型幫助患者進行ABO定型，通常可以解決或確認血清學所懷疑的A或B抗原變異體問題[6]。

3.4 鑒別弱D抗原和RhD陰性

D抗原具有臨床意義，在基因水平上定義了許多D變異體。從臨床角度來看，特別重要的是區分弱D與部分D表型。部分D表型個體可以產生抗D同種抗體，而弱D表型個體不能。某些D抗原變異體的D抗原性非常弱，使用血清學方法難以確認，容易被誤定型為RhD陰性。比如常見于亞洲人中的RhDEL型，常被誤定為RhD陰性，因此需要通過基因分型鑒別是否是RhD陰性。目前已經有報告提出在臨床實踐中應該對血清學弱D表型患者進行RhD基因分型[10]。

3.5 選擇基因型匹配供者

雖然對于大多數接受輸血患者不需要基因型匹配的供者，但是對某些特定患者需要個體化處理。比如有1例鐮刀型細胞貧血病患者，RH基因分型顯示是Dce純合子表型，攜帶2個RHCE*ce48C等位基因。該等位基因編碼RHCE基因外顯子1區域第16位半胱氨酸，與Dce表型相關，由于缺乏檢測RHCE*ce48C表型的抗血清，患者只能接受隨機供者血液，從而導致產生抗e抗體和溶血。而如果使用基因分型，選擇RHCE*ce48C等位基因匹配血液輸注會取得良好的效果[11]。在血清學鑒定為Dce表型的中國人中，大約有1/3的個體攜帶有RHCE*ce48C等位基因，因此遇到輸血產生抗體和溶血的患者應該考慮此等位基因是否匹配。

3.6 無效型鑒定

無效型個體比較少見，通常是在患者已經產生抗體后才被發現，這些抗體一般對應高頻率抗原。現在可以在輸血前對患者做無效型基因檢測，確認患者是否是無效型，以避免輸血后產生抗體。

3.7 協助解決復雜的抗體檢測

由于多種原因可能使鑒定血型抗體變得復雜，如受檢血清含有同種抗體和自身抗體、涉及到一些高頻率或低頻率的抗體和弱反應的抗體、配組紅細胞缺少相應抗原的抗體。使用基因分型有助于鑒定抗體。

4 血型基因分型用于預測供者血型

4.1 大規模的獻血者血型基因分型

對于由于輸血、妊娠、組織器官移植等同種免疫作用產生血型抗體的患者，需要輸注相應抗原陰性的血液。血液中心的任務之一是提供ABO和D以外的特定抗原陰性血液。如果使用標準抗血清篩查，不僅耗時且費用昂貴，而且不一定能夠獲得所有的分型試劑。血液中心可以放棄血清學篩查，代之以預先對獻血者紅細胞基因進行分型，并整合到血液供應鏈中，以滿足臨床對抗原陰性血液的需求。FLEGEL等[12]報道了43 966例獻血者42個紅細胞抗原基因分型結果，獲得1 667 026個基因型數據，發現728 482個抗原陰性基因型。在5 672例患者中，有5 661例(99.8%)需要抗原陰性紅細胞制劑，其中5 339例(95%)找到抗原陰性血液。紅細胞基因分型有可能改變將來的供血方式。基因型數據易于在線查詢，可以減少或避免血清學篩查，為患者提供廉價安全的抗原陰性紅細胞制劑。

4.2 篩選無效型獻血者

攜帶無效等位基因的個體，不表現相應血型抗原，接受血液輸注很容易產生血型抗體，為此需要使用罕見的無效型獻血者血液。篩選無效型獻血者需要大量標準抗血清，在缺少相應抗血清的情況下，即可以使用DNA做基因分型[13]。

[1] STORRY J R, CASTILHO L, CHEN Q, et al. International society of blood transfusion working party on red cell immunogenetics and terminology: Report of the Seoul and London meetings[S]. ISBT Science Series, 2016, 11:118-122.

[2] The Blood Group Antigen Gene Mutation Database. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gv/mhc/xslcgi.cgi?cmd=bgmut/home[EB/OL]. 2017-05-26.

[3] 趙桐茂. 免疫血液學基礎[M]. 北京：人民衛生出版社, 2017：50-72.

[4] COLLINS F, VARMUS H. A new initiative on precision me-dicine[J]. N Engl J Med, 2015,372(9):793-795.

[5] DENOMME G A, ANANI W Q, AVENT N D, et al. Red cell genotyping precision medicine:A conference summary[J]. Ther Adv Hematol, 2017,8(10):277-291.

[6] FLEGEL W A, CASTILHO L, HEATON W A, et al. Molecular immunohaematology round table discussions at the AABB Annual Meeting, Anaheim 2015[J]. Blood Transfus, 2016,14(6):557-565.

[7] The AABB Standard Program Committee. Standards for molecular testing for red cell, platelet, and neutrophil antigens[M]. 3rd.Maryland: Bethesda, 2016:7-9.

[8] LIU Z. Establishment of reference panels for blood group geno-typing tests. https://www.fda.gov/BiologicsBlood Vaccines/ScienceResearch/BiologicsResearchAreas/ucm352425.htm[EB/OL]. 2017-11-23.

[9] CHEN Y, ZHAO T. Application of a multiplex PCR genotyping assay of 31 red blood cell antigens for establishment of a panel of reference DNA in China[J]. Asia Pacific Journal of Blood Types and Genes, 2017,1(4):13-16.

[10] SANDLER S G, FLEGEL W A, WESTHOFF C M, et al. It’s time to phase in RHD genotyping for patients with a serological weak D phenotype[J]. Transfusion, 2015,55(3):680-689.

[11] LAPADAT R, MYEYER E, JOSEPHSON C. et al. Exon sequencing improves red blood cell phenotype matching in a patient homozygous for the Rhce*Ce48c allele[J]. Transfusion, 2015,55(3):152A.

[12] FLEGEL W A, GOTTSCHALL J L, DENOMME G A. Integration of red cell genotyping into the blood supply chain: A population-based study[J]. Lancet Haematol, 2015,2(7):e282.

[13] FLEGEL W A, GOTTSCHALL J L, DENOMME G A. Implementing mass-scale red cell genotyping at a blood center[J]. Transfusion, 2015,55(11):2610-2615.