人毛囊間充質干細胞臨床應用的研究進展

周 丹,趙 輝,趙 洋,劉晉宇

(1.吉林大學第二醫院兒科，吉林 長春 130041；2.吉林大學公共衛生學院衛生毒理學教研室，吉林 長春 130021)

毛囊是皮膚附屬器之一，起源于胚胎發育時期表皮與間充質間相互作用。人毛囊不斷經歷生長期、退行期和靜止期，周而復始，形成毛囊周期。毛囊周期伴隨人類一生，同時毛囊還表達胚胎干細胞標志物sry相關HMG盒轉錄因子2(sry-related HMG box-containing transfactor2，SOX2)，因此毛囊被認為是成體內胚胎組織之外唯一存在的胚胎樣組織。毛囊中含有多種干細胞，包括角朊干細胞、黑色素干細胞、神經脊干細胞和間充質干細胞。這些干細胞在時空上相互作用，共同維持毛囊的自我更新和毛囊周期正常運行。其中毛囊來源的間充質干細胞(hair follicle-derived mesenchymal stem cells, HF-MSCs)是成體干細胞家族成員之一，不僅表達間充質干細胞標志物如CD44、CD73、CD90和CD105，還具有分化為脂肪、骨、軟骨、平滑肌和神經等多種組織特異性細胞的潛能[1]。來源于人的HF-MSCs被稱為人毛囊間充質干細胞(human hair follicle-derived mesenchymal stem cells, hHF-MSCs)。人毛囊來源豐富、獲取方便、獲取微創且幾乎不受年齡的限制，因此作為自體干細胞來源具有其他成體組織來源的干細胞難以比擬的優勢。毛囊干細胞已經在臨床上用于脫發的治療[2]，近年來國內外學者對hHF-MSCs的生物學和再生醫學方面在體內及體外均進行了一些研究，并取得了一定的進展，但國外關于hHF-MSCs的綜述[3]較少，國內尚未見相關綜述。本文對hHF-MSCs的臨床應用前景做簡要概述。

1 hHF-MSCs作為自體細胞用于制備誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells, IPS)

干細胞的研究者們最早將研究焦點集中于胚胎干細胞。胚胎干細胞是指早期胚胎(原腸胚期之前)或原始性腺中分離出來的一類細胞，其具有體外培養無限增殖、自我更新和發育成完整個體的潛能，屬于全能干細胞。但利用胚胎干細胞開展再生醫學研究存在如下問題：倫理限制、來源有限和致瘤性。為解決胚胎干細胞研究和應用過程中存在的上述問題，日本科學家[4-5]通過核移植技術在小鼠體內導入4種轉錄因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4，成功地將小鼠的體細胞重新編碼成為胚胎樣干細胞，即IPS。IPS的誕生不但可以解決胚胎干細胞的倫理和來源有限問題，同時也可解決成體干細胞分化能力有限和異體來源存在免疫排斥反應的問題，為藥物篩選、毒理學和再生醫學研究提供了亞全能的自體干細胞來源，成為干細胞研究史上重要的里程碑。關于IPS的研究于2007—2008年被《Science》、《Cell》和《Nature》等權威雜志評選為年度重大科學進展和最受人們關注的領域之一[6-7]。Muchkaeva等[8]及Wang等[9]分別通過導入Yamanaka應用過的Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4等4種轉錄因子，成功地將人毛囊真皮乳頭細胞和hHF-MSCs重新編程為IPS細胞。由hHF-MSCs重編程的hHF-IPS具有正常的二倍體核型，表達階段特異性胚胎表面抗原3(stage-specific embryonic antigens，SSEA-3)、SSEA-4、腫瘤排斥抗原1-60(tumor rejection antigen，Tra-1-60)和Tra-1-81等胚胎干細胞特異性標志物及多潛能轉錄因子Nanog和Oct4等。hHF-IPS植入非肥胖糖尿病/重癥聯合免疫缺陷(non-obese diabetic-severe combined immune deficency，NOD-SCID)小鼠體內，可產生外胚層、中胚層和內胚層組織細胞成分的畸胎瘤。在此基礎上，Shi等[10]于2016年通過添加不同細胞因子對hHF-MSCs進行4個階段培養誘導，具體如下：第1階段加入激活素A(activin A)，誘導hHF-IPS向內胚層分化；第2階段加入成纖維細胞生長因子4(FGF-4)和骨形態發生蛋白4(BMP-4)促其向肝細胞特化；第3階段加入肝細胞生長因子(HGF)促肝祖細胞增殖；第4階段加入腫瘤抑制素M(OSM)和地塞米松促肝細胞成熟。通過上述實驗流程，最終在體外成功地將hHF-IPSC 分化為具有成熟肝細胞功能的肝樣細胞，有望為肝病的治療提供重要的自體肝細胞來源，具有重要的臨床應用前景。

2 hHF-MSC的組織工程學應用前景

Lako 等[11]首先通過向經過致命性照射劑量的小鼠體內移植鼠毛囊毛乳頭/鞘細胞重新建立了小鼠的造血系統，陸續有學者進一步證實了嚙齒動物毛囊毛乳頭/鞘細胞具有MSCs類似的多向分化潛能[12]。Vivek 等[13]發現：HF-MSCs表達 CD90、CD105、CD44 和CD73等間充質干細胞表面標志，但不表達造血細胞(CD34和CD45)和內皮細胞(CD144)標志。通過基因表達、功能分析和克隆實驗[14-15]顯示：hHF-MSCs 可在體外分化成脂肪、骨和軟骨細胞，這與骨髓來源間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSC)的分化潛能相一致。BMMSC是目前研究最為廣泛、最受學者關注、取得研究成果最多，也是最有希望應用于臨床的成體干細胞，由于hHF-MSCs與BMMSC的相似性[16]，因此hHF-MSCs的研究越來越受到人們的關注，尤其是hHF-MSCs在組織工程學上的應用前景[17]。

與BMMSC類似，HF-MSCs表達CD90、CD105、CD44和CD73等間充質干細胞表面標志，同時具有成脂、成骨和成軟骨細胞分化能力。除此之外，HF-MSC 還具有分化為平滑肌細胞、神經元、神經膠質細胞和黑色素細胞的潛能[18-19]。Yu等[20]將HF-MSCs 置于不含血清和堿性成纖維細胞生長因子的胚胎干細胞培養液中培養，發現HF-MSCs可形成保持數代不分化的神經球，并可維持其不斷向肌肉、神經及黑色素細胞分化的能力。Peng等[21]利用血管平滑肌細胞肌球蛋白啟動子驅動綠色熒光蛋白的慢病毒質粒，從hHF-MSCs中分離出血管平滑肌細胞，并以該細胞為種子細胞，構建出世界上第一個人毛囊干細胞來源的組織工程小口徑血管。該組織工程血管對氯化鉀和去甲腎上腺素等激活劑的刺激產生收縮反應[22-23]。進一步研究[24]顯示：微小RNA(miR-18b)通過SMAD2信號通路，負調控TGF-β1誘導的hHF-MSCs向血管平滑肌細胞分化。該研究對hHF-MSCs分化過程中的信號通路和調節機制方面進行了深入的探索，為其應用于臨床打下基礎。

3 hHF-MSCs作為基因治療的載體細胞

BMMSC被證實具有易于外源性基因導入，轉染率高，穩定、高效表達外源基因的特點，成為外來基因導入體內良好的載體細胞。不僅如此，轉基因的MSCs 在體內可以定向遷移到受損的病變部位，在激活內源性祖細胞的同時，釋放一些生物因子，改善病變組織周圍的微環境，修復受損組織[25-29]。轉基因MSCs具有雙重作用：一方面表達目的基因，治療相關疾病；另一方面還可以通過旁分泌作用，修復重建病變受損的組織。Wu等[30]首次將hHF-MSCs作為糖尿病基因治療的靶細胞，通過慢病毒載體將釋放可控的人胰島素基因導入hHF-MSCs中，制備出轉基因工程細胞。這種轉基因工程細胞仍表達CD44、CD73、CD90和CD105等MSCs 的特異性標記物，同時具有向脂肪細胞、骨細胞分化的能力；移植到糖尿病模型鼠內，在雷帕霉素的作用下釋放胰島素，逆轉糖尿病高血糖，開辟了在臨床上轉基因治療糖尿病的新途徑，證明了HF-MSCs作為基因治療靶細胞治療相關疾病的可行性。本課題組通過應用攜帶人肝細胞生長因子(human hepatocyte growth factor，hHGF)基因的慢病毒轉染hHF-MSCs，構建了具有過表達hHGF的轉基因hHF-MSCs(HGF-MSCs)。構建的HGF-MSCs仍保留MSCs的生物學特征：表達MSC表面標志，同時具有向骨細胞和脂肪細胞的分化潛能[31]，有望可以應用于急慢性肝損害的修復治療。上述實驗表明：hHF-MSCs可以通過病毒導入其他基因，并不影響其生物學特性。由此可見以自體的hHF-MSC作為基因治療載體細胞，具有巨大的臨床應用潛能。

4 結 語

hHF-MSCs具有如下優點：①來源優勢。毛囊基本伴隨人的一生，來源豐富；②獲取優勢。不管是BMMSC還是臍帶、脂肪間充質干細胞均存在獲取不便的問題，如獲取骨髓、脂肪均是有創性操作，取材部位本身即有發生感染的危險，而且取出標本極易被外部環境污染，因此對取材后標本的保存有極其嚴格的要求。而hHF-MSCs的獲取方式已經由研究初期的取頭皮、毛囊發展成為直接拔取頭發，因此對機體造成的損傷微乎其微；③細胞分離方法優勢。HF-MSCs的實驗分離方法已經成熟，方法簡便，易于操作；④體外擴增優勢。利用生物反應器技術，短期內可將hHF-MSCs擴增到數十億以上，且擴增的細胞仍保留MSC原代生物學特征，因此完全滿足臨床應用所需的干細胞數量和質量[32]；⑤免疫原性低。hHF-MSCs取材于自體毛發而避免免疫排斥反應；⑥倫理學優勢。hHF-MSCs非異體取材，從而避免異體移植所導致的倫理學問題。hHF-MSC的發現時間晚于其他干細胞，目前的實驗研究很大部分是基于其他干細胞，如最為常用的BMMSC研究基礎之上進行的，因此其存在如下缺點：①其作為體細胞向其他組織、細胞分化的誘導條件及信號通路尚在摸索中[33-35]，因此研究范圍有限；②作為轉基因治療手段在活體內的安全性及穩定性尚待進一步證實；③目前國內、外掌握HF-MSCs制備技術的實驗室較少，因此獲得的實驗數據相對較少，尚缺乏HF-MSCs的相關大數據。總之，HF-MSCs作為干細胞家族的一員，目前已經取得的研究成果有力地證明了其將是器官移植、組織工程學和轉基因治療的種子細胞，具有廣闊的臨床應用前景。