外泌體的產生及其生物學作用的研究進展

王 璐，孟 琳，劉樹威，張 愷，孟許亞，王梓霖，孫宏晨,

(1.吉林省牙發育及頜骨重塑與再生重點實驗室，吉林 長春 130021；2.吉林大學口腔醫院口腔病理科，吉林 長春 130021；3.吉林大學化學學院超分子結構與材料國家重點實驗室，吉林 長春 130012)

外泌體為直徑40～100 nm的細胞外囊泡，具有雙層脂質結構。1983年在研究網織紅細胞成熟為紅細胞過程中產生轉鐵蛋白時發現了外泌體[1]。當時外泌體被認為是細胞處理廢物的一種手段而被研究者所忽略。研究[2]表明：外泌體作為信號分子的載體，可以介導細胞間通信和細胞間大分子的傳遞，促進蛋白質、脂質、mRNA、miRNA和DNA的轉運及疾病的發展，將參與生理和病理過程的信號分子傳遞到受體細胞。外泌體不是細胞合成的單純聚合物，而是由細胞膜出芽而來，其能更好地被宿主耐受，同時也可以作為藥物的有效載體。由于外泌體廣泛存在于體液中，不僅容易獲取且攜帶了其來源細胞內的特異性物質，使得其在科研及臨床方面具有潛在用途[3]。近年來，隨著科學技術的發展，外泌體受到越來越多的關注。然而，關于外泌體生物學的根本問題仍然未得到有效解決，進一步深入研究外泌體獨特的生物學結構和功能，探討這些結構的生物學意義，是外泌體研究中迫切需要解決的問題。本文對外泌體的產生機制、分離與鑒定、其對機體免疫過程和疾病的發生發展的作用等方面進行了全面的綜述，有助于理解外泌體的生物學意義、結構和功能。

1 外泌體的簡介

1.1 外泌體的分泌 雖然研究者對細胞釋放外泌體的具體過程知之甚少，但大多數含有內膜系統的哺乳動物細胞均可分泌外泌體。外泌體有多種分泌途徑：一種是組成型分泌途徑，例如免疫系統的B細胞、樹突狀細胞(DCs)和肥大細胞，對外泌體的研究大部分來自于免疫細胞，而目前在非免疫細胞中生理性外泌體的分泌很大程度上是未知的；另一種途徑是通過細胞間相互作用刺激分泌外泌體，例如鼠DCs在與抗原特異性CD4+T淋巴細胞相互作用時可分泌更高水平的外泌體[4]；其他類型的細胞還可以通過鈣離子載體或其他刺激分泌外泌體[5]。

1.2 外泌體的產生機制 大多數常規的膜出芽過程是使膜從細胞器變形到細胞質中，而外泌體是由于細胞膜內吞形成內體，內體限制膜發生多處凹陷，向內出芽形成微囊泡(intraluminal vesicles，ILVs)，從而轉變為具有動態亞細胞結構的多囊泡體 (multi-vesicle bodys，MVBs)，即晚期內體。 MVBs可以在內體限制膜處通過至少2種機制產生：一種是內吞體分選轉運復合體機制(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)，另一種是非依賴性的ESCRT機制。ESCRT機制由一組胞質蛋白復合物發揮作用，其能識別泛素化修飾的膜蛋白。泛素標記物被第1個ESCRT復合物ESCRT-0識別，ESCRT-0富集到內體膜并將泛素化的物質傳遞給ESCRTⅠ和ESCRTⅡ，ESCRTⅠ中的Tsg101識別二硫鍵誘導內體膜凹陷，再通過ESCRTⅢ剪切芽頸，形成MVBs[6]。但在無ESCRT的情況下，MVBs仍然可以形成，如附屬蛋白質ALG-2相互作用蛋白X(Alix)能夠與胞內銜接蛋白syntenin直接結合參與形成外泌體。這些ESCRT非依賴性MVBs的產生可以通過MVBs上豐富的四跨膜蛋白CD63-α，也可以通過神經酰胺誘導細胞膜出芽促進MVBs的形成[7]。

MVBs可以與溶酶體融合，其內容物被降解和再循環；MVBs還可以與質膜融合，分泌到細胞外(即所謂的外泌體)。MVBs上的膽固醇水平在調節其分選中發揮重要作用，富含膽固醇的MVBs被靶向分選至細胞膜作為外泌體釋放，而低膽固醇的MVBs被靶向運送到溶酶體[8]。研究者[9]在研究阿爾茨海默病的發生發展時發現：四次跨膜蛋白6(TSPAN6)可以抑制淀粉樣前體蛋白C端片段(APP-CTF)進入溶酶體，促進含有APP-CTF的外泌體的分泌，從而刺激產生神經變性相關肽Aβ。

1.3 外泌體的細胞間傳遞 外泌體在細胞間通訊中發揮重要作用，可以影響細胞的多種功能，包括細胞因子的產生、細胞增殖、細胞凋亡和代謝等[10]。目前認為，外泌體主要通過以下方式與受體細胞結合：①外泌體將膜蛋白或其內容物轉移至受體細胞，被受體細胞膜完全吞噬，這一過程需要非常規脂質LBPA和附屬蛋白質Alix；②外泌體膜與受體細胞膜直接融合；③外泌體上的跨膜蛋白直接作用于受體細胞膜表面的信號分子。例如，濾泡樹突細胞分泌的外泌體攜MHC-跨膜蛋白，其可激活B淋巴細胞和T淋巴細胞表面的信號分子[11]。外泌體與受體細胞以何種方式結合取決于外泌體的大小及外泌體攜帶的物質。

2 外泌體的分離與鑒定

外泌體的分離方法包括差速離心法、ExoQuick外泌體快速提取試劑盒法、免疫親和沉降法、蔗糖密度梯度-超速離心法和微流體分離法等[12]。其中差速離心法是最常用的外泌體分離方法，即通過較低的離心速度從培養基中分離出顆粒較大的物質，然后外泌體、小胞外囊泡及蛋白質再以非常高的速度(100 000×g)離心產生沉淀[13]。因此，差速離心只能富集而不能純化外泌體。富集的外泌體、小胞外囊泡及蛋白質通過生物化學、質譜或電子顯微鏡等相關技術進行物理、化學及生物表征，從而得到進一步鑒別。

然而離心后沉淀物中細胞外囊泡和外泌體等難以進行鑒定分析。通常，對于普通細胞器(如高爾基體和線粒體等)而言，可以利用其特異性生物標記物進行鑒定。外泌體不是靜態細胞器，其經歷了內體、ILVs和MVBs一系列連續成熟的過程，在此過程中不斷獲取并失去不同的蛋白質，因此外泌體不會有一個特異性標記物。但外泌體會表達一些四次跨膜蛋白(CD63、CD81和CD9)，其中CD63可以用做目前研究外泌體的標記物，如在研究非依賴性ESCRT的MVBs的形成時需要CD63[14]。在許多研究中Tsg101也被用作外泌體的標記物，參與ESCRT依賴性外泌體的形成。

3 外泌體的主要組分

3.1 蛋白質 超過4 600種蛋白質與外泌體有關。外泌體蛋白有以下幾類：①外泌體中常見的蛋白質多與其生物發生機制有關，外泌體含有的細胞質蛋白，如膜蛋白和RAB蛋白，可以促進MVBs與細胞膜的融合及外泌體的釋放；Tsg-101及附屬蛋白質Alix參與ESCRT過程，促進內體膜的凹陷。②外泌體含有參與抗原呈遞的蛋白質，如CD1、MHCⅠ和MHCⅡ，其在免疫調節中發揮重要作用，MHCⅠ還參與向T細胞呈遞抗原的生理過程。外泌體表面還存在熱休克蛋白，如HSP70和HSP90，促進了抗原肽與MHCⅠ及MHCⅡ的結合[15]。③外泌體含有信號轉導蛋白，如G蛋白和蛋白激酶[16]。④外泌體含有豐富的蛋白水解酶，這表明外泌體能夠促進細胞轉移。⑤外泌體中還含有細胞質微管蛋白、肌動蛋白和肌動蛋白結合蛋白。但目前未發現外泌體中含有與內質網、高爾基體和細胞核相關的蛋白質[17]。腫瘤細胞所分泌的外泌體可以攜帶特定的蛋白質，有助于腫瘤的診斷和檢測。研究[18]表明：腸道簡質瘤分泌的外泌體富含豐富的診斷標志物，如KIT、CD34、ANO1、PROM1、PRKCQ和ENG。

3.2 核 酸 外泌體所具有的可以將其與其他生物囊泡區分開的一大特征就是含有大量核苷酸，在外泌體內已經發現了DNA、RNA、miRNA及非編碼RNA等。在外泌體中發現的mRNA為功能性RNA，轉運到靶細胞后可以被翻譯為蛋白質。外泌體中的miRNA，如let-7、miR-1、miR-15、miR-16、miR-151和miR-375在血管發生、胞吐作用和腫瘤發生等過程中發揮重要作用[19]。外泌體還富含腫瘤轉移有關的miRNA，如來自于乳腺癌細胞系MCF-10A和MDA-MB-231的外泌體富含miRNA-105,其可減少內皮細胞中ZO-1基因的表達，促進乳腺癌向肺和腦的轉移[20]。外泌體中的miR-21和miR-29a可作為配體與Toll樣受體(TLR)結合激活免疫細胞[21]。

外泌體miRNA可以穩定地存在于血液、尿液和其他體液中。通過外泌體表面的特異性蛋白可以確定其組織或細胞來源。因此，外泌體miRNA可以用作生物標志物輔助疾病的臨床診斷。例如，外泌體miRNA(如let-7a、miR-1229、miR-1246、miR-150、miR-21、miR-223和miR-23a)可以作為診斷結腸直腸癌的生物標志物[22]。miR-21和miR-181a-5p可以用于區分乳頭狀甲狀腺癌及濾泡狀甲狀腺癌[23]。miR-1290和miR-375可以用作診斷前列腺癌預后的生物標志物[24]。

3.3 脂 質 外泌體的脂質成分包括鞘磷脂、膽固醇、神經節苷脂GM3、飽和脂肪酸、磷脂酰絲氨酸和神經酰胺。與其來源細胞的細胞膜比較，外泌體膜表面的磷脂酰膽堿和二酰基甘油含量降低[25]。但外泌體表面富含磷脂酰絲氨酸，這有利于受體細胞內化，在外泌體的生物功能方面發揮重要作用[26]。

4 外泌體與免疫

外泌體可以通過直接呈遞或交叉呈遞的方式向T細胞呈遞抗原肽-MHC復合物，介導其對抗原的免疫應答。直接呈遞是指外泌體表面的抗原肽-MHC復合物直接被T細胞捕獲，從而激活T細胞。交叉呈遞是指抗原呈遞細胞(APCs)識別外泌體攜帶的抗原后，將抗原肽-MHC復合物呈遞給CD8+T細胞。另外，外泌體表面的乳脂球表皮生長因子(MFGE8)、四糖蛋白和磷脂酰絲氨酸也可以直接或間接介導外泌體與APCs的結合[27]。

外泌體可以通過介導促炎癥反應促進免疫反應。被細菌感染的巨噬細胞分泌的外泌體可以調節免疫反應，其可以刺激巨噬細胞和嗜中性粒細胞分泌促炎癥因子，如腫瘤壞死因子α(TNF-α)和調節激活正常T細胞表達分泌因子(RANTES)。成熟的DCs分泌的外泌體可以通過TNF通路激活免疫反應。外泌體內的TNF可以誘導上皮細胞分泌促炎細胞因子[單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、白細胞介素8(IL-8)、TNF-α和RANTES]，從而在免疫應答中發揮關鍵作用[28]。外泌體還可以增強巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用來促進免疫反應。如攜帶信號調節蛋白SIRPα變體的外泌體可以與CD47結合，破壞CD47與腫瘤細胞表面的SIRPα的相互作用，增強巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用[29]。

腫瘤細胞分泌的外泌體也可以抑制免疫反應。腫瘤細胞通過抑制T細胞和NK細胞活性，刺激骨髓來源的免疫抑制性細胞(MDSCs)來抑制免疫反應。研究[30]表明：鼠B16黑素瘤細胞釋放的外泌體對小鼠巨噬細胞干擾素γ(IFN-γ)的表達有抑制作用，進而影響CD4+T細胞的抗原呈遞。此外，研究[31]還表明：腫瘤細胞分泌的外泌體可以誘導T細胞凋亡，促進免疫逃逸。黑素瘤細胞中存在一些含有黑素小體的MVBs，這種MVBs分泌的外泌體內含有Fasl, Fasl可以誘導Jurkat細胞和淋巴細胞凋亡。外泌體分泌的FasL和TNF也可以促進人結腸直腸癌中的T細胞凋亡[32]。

5 外泌體與疾病

5.1 外泌體與腫瘤

腫瘤細胞分泌的外泌體可以促進癌癥的侵襲和轉移。通過自分泌、旁分泌和內分泌等方式，外泌體可以在局部和遠處的轉移位點形成有利于轉移和侵襲的細胞微環境。研究[33]表明：結腸直腸癌細胞分泌的外泌體富含細胞周期相關的mRNA，可以促進內皮細胞的增殖，進而促進腫瘤的生長和轉移。胃癌細胞株SGC7901分泌的外泌體通過激活PI3K/Akt和絲裂原活化蛋白激酶/細胞外調節蛋白激酶信號通路促進SGC7901細胞和其他胃癌細胞株BGC823的細胞增殖[34]。在腫瘤侵襲期間，外泌體可以促進腫瘤細胞和周圍間質細胞間的通信。如胃腸道間質細胞瘤通過向周圍間質釋放含有蛋白酪氨酸激酶的外泌體，誘導平滑肌祖細胞向癌細胞的細胞表型轉化[35]。

腫瘤細胞分泌的外泌體可以促進癌癥部位的血管生成。缺氧狀態下的癌細胞可以分泌一些外泌體促進腫瘤部位的血管生成。腫瘤部位血管生成主要由缺氧誘導因子(HIF)介導。研究[36]表明：當乳腺癌細胞輕度(1%)和嚴重(0.1%)缺氧時，從培養基中分離的外泌體比例分別為(32.3±4.8)%和(90.9±7.1)%，癌細胞分泌外泌體的增加表明其可以調節腫瘤部位的低氧微環境。乳腺癌細胞分泌的外泌體可以促進血管內皮細胞中蛋白酶激活受體2介導的EGF信號通路促進腫瘤部位的血管生成[37]。膠質母細胞瘤樣干細胞分泌的外泌體可以將血管內皮生長因子A(VEGF-A)靶向運輸到內皮細胞促進血管生成[38]。

外泌體有助于腫瘤微環境中的上皮間充質轉化(EMT)。研究[39]表明：在一些腫瘤細胞分泌的外泌體中存在EMT誘導因子，如基質金屬蛋白酶(MMP)、白細胞介素6(IL-6)、轉化生長因子β(TGF-β)、膜聯蛋白A2、整合素3和肝細胞源性生長因子，表明癌細胞分泌的外泌體可能參與EMT過程。另外，Josson等[40]研究證明：攜帶miR-409的成纖維細胞分泌的外泌體可以在前列腺癌的腫瘤微環境中誘導其相鄰上皮細胞的EMT。腫瘤細胞分泌的外泌體可以增加其耐藥性。癌細胞通過向外分泌外泌體的方式排出化療藥物，從而增強其對化療藥物的抵抗力。研究171種抗癌藥對NCI60細胞系的作用結果[41]顯示：NCI60細胞系的耐藥性與其分泌的外泌體數量呈正相關關系。另外，外泌體還以其他方式增強癌細胞的耐藥性。例如，當順鉑(DDP)加入肺癌細胞(A549)的培養基時，A549分泌的外泌體中與DDP敏感性相關的幾種miRNA和mRNA含量明顯增多，但具體機制仍需進一步研究。來自肝癌細胞的外泌體富含長非編碼RNA-RoR，可以通過介導TGFβ信號通路減少化療過程中的細胞死亡數量，增強癌細胞耐藥性[42]。另外，癌細胞分泌的外泌體中細胞凋亡抑制劑IAP的高表達也與疾病進展和其耐藥性相關[43]。

5.2 外泌體與其他疾病

除了與腫瘤發生關系密切外，外泌體還是神經系統疾病致病因子的載體，例如神經變性相關肽Aβ(阿爾茨海默病)、tau(許多神經變性疾病)、朊病毒(傳染性海綿狀腦病)、α-突觸核蛋白(突觸核蛋白病，包括帕金森病)和超氧化物歧化酶1(肌萎縮性側索硬化等)。在神經變性相關蛋白中，只有一些是整合的膜蛋白，即蛋白質位于脂質雙層內，而不是細胞內。將蛋白質負載到ILVs或者外泌體中，其更容易與細胞膜表面蛋白結合。目前為止，已經在外泌體中檢測到Aβ和PrPc存在，但尚未證明其他膜蛋白的存在[44]。

外泌體還與心血管疾病、代謝性疾病、損傷性疾病以及肌肉骨骼系統疾病有關。從主動脈瘤患者的血漿中分離出的外泌體含有CD9和脂聯素，增加了機體患肥胖和代謝綜合征的概率[45]。含有胱氨酸C和CD14蛋白的外泌體與動脈粥樣斑塊大小有關，影響心血管疾病的發病率及患者的死亡率[46]。腸系膜淋巴結細胞分泌的外泌體攜帶toll樣受體4來激活肺泡巨噬細胞，從而誘導急性肺損傷的產生[47]。從老年小鼠的骨髓間質液中分離出外泌體中miR-183的含量明顯升高，加快了骨丟失的速度[48]。從發炎關節的滑液中分離出來的外泌體刺激巨噬細胞釋放炎性細胞因子、基質金屬蛋白酶和趨化因子，介導骨關節炎的發生發展[49]。

6 展 望

在各種生理和病理過程中，外泌體通過與受體細胞特異性結合并傳遞各種生物學信息從而發揮重要的生物學作用。目前對外泌體基本的生物功能，即其如何介導不同疾病的發病機制知之甚少，進一步深入研究外泌體獨特的生物學結構和功能，探討這些結構的生物學意義，不僅為各種疾病提供了一種安全便捷的早期診斷標記物，也為個體生物學治療提供了一種靶向性策略，還能為未來藥物載體的研發開啟一條全新的思路。