大鼠結腸原代成纖維細胞的分離、培養和鑒定

閻 慧，婁石磊，苗永迪，豈 蕊，郭子碩，邱 悅，孫 聰

(長春中醫藥大學臨床醫學院生物化學教研室，吉林 長春 130117)

近年來，器官纖維化已經成為世界醫學研究的重點課題之一。其中結腸纖維化是克羅恩病(Crohn’s disease，CD)和輻射性腸炎等多種慢性腸病較嚴重的并發癥[1]。成纖維細胞作為腸纖維化的主要效應細胞，增殖過度時分泌大量以膠原為主的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)和細胞因子，是腸纖維化發生發展的中心環節[2-3]。隨著腸纖維化研究的不斷深入，成纖維細胞的功能及相應的細胞信號轉導機制研究已經成為研究的重點。安彩萍等[4]發現：隔藥灸可下調克羅恩病腸纖維化大鼠成纖維細胞中結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF) 和纖維連接蛋白(fibronectin,FN)的表達。惠毅等[5]發現：烏梅丸可通過抑制結腸上皮細胞的過度凋亡治療大鼠潰瘍性結腸炎，其機制與抑制Bcl-2和Bax的表達有關。目前對結腸成纖維細胞的研究較少，但腸道慢性疾病導致結腸纖維化已經被證實。本課題組擬從體外培養成纖維細胞入手，通過改進傳統的組織塊貼壁法，采用胰酶聯合差速貼壁培養法結合組織胚胎學、形態學和免疫組織化學法探討結腸成纖維細胞的原代培養技術，為中藥有效成分干預腸纖維化疾病的體外研究提供細胞模型，為研究腸道慢性疾病的發病機制和臨床治療奠定前期實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器健康成年Wistar雄性大鼠(封閉群)，體質量約200 g，SPF級，購自吉林省長春市億斯實驗動物技術有限責任公司，動物合格證號：SCXK(吉)2011-0004。大鼠胸主動脈平滑肌A7R5細胞，由長春中醫藥大學生物化學實驗室提供。高糖DMED干粉(美國Gibco公司)，胎牛血清(上海依科賽生物公司)，胰蛋白酶(1∶250)(美國GenView公司)，Anti-α-SMA、Anti-S100A4、Anti-E-cadherin和Anti-Vimentin(北京博奧森生物技術有限公司)，超敏型HRP免疫組織化學試劑盒(上海生物工程股份有限公司)。Nikon Eclipse TS100熒光倒置顯微成像系統(日本尼康儀器有限公司)，Thermo 3111型CO2細胞培養箱(美國Thermo公司)，TOMY ES-315高壓滅菌鍋(日本TOMY KOGYO公司)。

1.2 大鼠結腸成纖維細胞培養和分離成年Wistar雄性大鼠，禁食不禁水48 h，腹腔注射10%水合氯醛3.5 mL·kg-1。麻醉后浸泡入75%乙醇中進行外部消毒，轉至無菌操作間迅速打開腹腔截取大鼠結腸，放入含1×105U·L-1青霉素和1×105U·L-1鏈霉素的DMEM培養基中，反復沖洗結腸內殘余糞便。縱向切開結腸，剔除腸系膜和脂肪組織，用眼科鑷子仔細刮去漿膜層和肌層。移入超凈工作臺用PBS洗滌，用眼科剪子將黏膜層和黏膜下層組織剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小，均勻鋪布在細胞培養瓶中，組織間距0.5 cm。小心加入2 mL含10%胎牛血清、1×105U·L-1青霉素和1×105U·L-1鏈霉素的DMEM培養基，將培養瓶倒置放入培養箱中培養。2 h后輕輕翻轉培養瓶，使組織塊浸入培養基中靜置培養。3 d后換液，8～12 d后組織塊邊緣有大量細胞爬出。待細胞長滿瓶底，采用0.25%胰蛋白酶消化，再進行反復貼壁去除貼壁速度較慢的其他細胞，分離得到成纖維細胞[6-7]。采用熒光倒置顯微鏡觀察細胞形態表現。

1.3 大鼠結腸成纖維細胞HE染色取對數期成纖維細胞，0.25%胰蛋白酶消化，充分吹打，使之成單細胞懸液，接種到細胞爬片上。待細胞接近長滿后，吸出培養液，PBS洗滌3次，95%乙醇固定15 min。取出細胞爬片PBS洗滌2次，經蘇木素染色、稀鹽酸酒精分色、淡氨水藍化細胞核和伊紅染色，梯度乙醇逐級脫水，二甲苯透明處理3次，固定于載玻片上顯微鏡下觀察。

1.4 大鼠結腸成纖維細胞免疫組織化學鑒定分別取對數生長期的成纖維細胞和大鼠胸主動脈平滑肌A7R5細胞，0.25%胰蛋白酶消化，充分吹打成單細胞懸液，接種到細胞爬片上。待細胞接近長滿后，吸出培養液，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定20 min。取出細胞爬片PBS洗滌2次，加入0.5%Triton X-100 20 min，內源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育15 min，封閉液室溫封閉45 min。分別加入Anti-α-SMA、Anti-S100A4、Anti-E-cadherin和Anti-Vimentin 4℃過夜，次日室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，加入二抗37℃孵育1 h，PBS洗滌3次，DAB室溫顯色30 min。固定于載玻片上顯微鏡下觀察波形蛋白(Vimentin)、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、S100鈣結合蛋白A4(S100A4)和E鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達。

2 結 果

2.1 熒光倒置顯微鏡下大鼠結腸成纖維細胞形態表現熒光倒置顯微鏡下觀察：結腸黏膜組織塊貼壁培養8 d時成纖維細胞開始從組織塊邊緣爬出；生長到12 d時成纖維細胞增殖速度逐漸加快，細胞呈扁平多突的紡錘形或星形；生長到15～20 d時細胞已經達到80%融合狀態(圖1，見插頁四)。

2.2 大鼠結腸成纖維細胞HE染色結果顯微鏡下觀察：大鼠結腸成纖維細胞體積大且突起較多，細胞質被酸性染料伊紅染成粉紅色，細胞核被堿性的蘇木精染成藍紫色，且細胞核較大，呈卵圓形，著色較淺，核仁著色較深很明顯(圖2，見插頁四)。

2.3 大鼠結腸成纖維細胞免組織化學鑒定免疫組織化學染色結果顯示：大鼠結腸成纖維細胞呈扁平多突的紡錘形或星形，細胞規則、大小一致；大鼠胸主動脈平滑肌A7R5細胞呈多角形，細胞核呈卵圓形；結腸成纖維細胞中Vimentin蛋白呈陽性表達，α-SMA、E-cadherin和S100A4蛋白呈陰性表達；大鼠胸主動脈平滑肌A7R5細胞中Vimentin、α-SMA和E-cadherin蛋白呈陽性表達，S100A4蛋白呈陰性表達(圖3，見插頁四)。

3 討 論

腸纖維化是由于成纖維細胞異常增殖、ECM過度沉積導致，受多種細胞因子和信號通路調控。目前國內外多在動物體內進行研究，鮮有體外相關研究和報道。結腸位于消化道的末端，含有400多種細菌，構成復雜的微生態系統。體外培養成纖維細胞時為避免污染，截取組織后應立即放到含有青霉素和鏈霉素的培養基中沖洗。結腸由內向外分為黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層。黏膜層分為上皮層、固有層和黏膜肌層[8]，成纖維細胞定位于結腸黏膜固有層[9]，需認真剝離其他組織才能獲得成纖維細胞。

本研究結果顯示：原代培養結腸成纖維細胞初期生長緩慢，第8天細胞開始游出組織塊，第12天在顯微鏡下可觀察到組織塊周圍有大量細胞，15～20 d時已達到80%～90%融合狀態，鏡下觀察細胞生長呈旋渦狀或放射狀。雖然黏膜層也含有上皮細胞和平滑肌細胞，但成纖維細胞貼壁能力強，故采用時間差胰酶消化法和反復貼壁法進行結腸成纖維細胞的分離[10]。本研究結果顯示：結腸成纖維細胞對于0.25%胰蛋白酶的敏感度較弱，加入胰蛋白酶消化后，成纖維細胞收縮變圓過程較慢，需要1.5～2.0 min才能消化完全。

本研究分別檢測細胞中S100A4、Vimentin、α-SMA和E-cadherin的表達，并用大鼠胸主動脈平滑肌細胞進行對照來鑒定細胞種類。S100A4又稱成纖維細胞特異性蛋白1(fibroblast specific protein1，FSP-1)，是酸性的鈣結合蛋白家族的成員，具有調控細胞運動、侵襲和增生的功能，與細胞分化、凋亡和基質降解有關[11-12]。但本研究結果顯示：原代培養大鼠結腸成纖維細胞和平滑肌細胞中S100A4蛋白表達均呈陰性，故進一步采用Vimentin來鑒定細胞。Vimentin為Ⅲ型中間絲蛋白，主要表達于中胚層起源的間充質細胞中，在成纖維細胞中大量分布，可作為成纖維細胞的標記[13-14]。本研究結果顯示：原代培養的細胞中Vimentin蛋白表達陽性，但平滑肌細胞中Vimentin蛋白表達也呈陽性，雖初步鑒定成纖維細胞但卻無法與平滑肌細胞進行區分。α-SMA是細胞骨架的主要成分，是相對局限在平滑肌細胞中表達的少數基因之一，是公認的平滑肌細胞表型轉化標志物[15-16]。本研究結果顯示：原代培養的成纖維細胞中α-SMA蛋白不表達，而大鼠胸主動脈平滑肌細胞中α-SMA蛋白表達，說明培養的成纖維細胞中不含有平滑肌細胞。考慮成纖維細胞中還可能混有上皮細胞，故采用E-cadherin蛋白來區分，E-cadherin是鈣黏蛋白家族中的一員，主要位于上皮組織中，是一種Ca2+依賴的、同親型結合的細胞黏著糖蛋白，對胚胎發育的細胞識別、遷移、組織分化和組織器官構成具有重要作用[17-18]。E-cadherin可作為上皮來源細胞標志物，用來區別成纖維細胞與上皮細胞。本研究結果顯示：原代培養細胞中E-cadherin蛋白表達陰性，說明培養的成纖維細胞中無上皮細胞。

雖然文獻中報道S100A4是成纖維細胞的標記蛋白，但本實驗原代培養的大鼠結腸成纖維細胞中S100A4表達呈陰性，考慮可能與種屬和來源有關，也有文獻[19]表明結腸腺癌細胞表達S100A4而正常結腸組織成纖維細胞不表達S100A4。

本研究采用胰酶聯合差速組織塊貼壁培養法這一原代培養技術成功培養出大鼠結腸成纖維細胞，經細胞傳代驗證，該細胞在15代內均表現出成纖維細胞的特性，超過15代后增殖速度下降。本研究中的培養方法簡便易行，細胞純度高，增殖速度快，為研究腸纖維化疾病的作用機制、臨床治療奠定了前期實驗基礎。