環介導恒溫擴增技術在百日咳鮑特菌檢測中應用研究進展

郄春花 綜述，吳紅章 審校

(天津市第二人民醫院檢驗科，天津 300192)

核酸擴增技術是病原微生物檢測的重要武器，其中聚合酶鏈反應(PCR)技術已經在臨床檢驗中廣泛應用。與PCR相比，環介導恒溫擴增(LAMP)技術具有操作簡便，快速靈敏，對儀器和樣本質量要求低等優點，尤其適合病原微生物的即時檢驗。本文主要綜述了LAMP技術在百日咳即時檢驗中應用的研究進展。

1 百日咳的流行病學

百日咳是由百日咳鮑特菌感染引起的一種嚴重急性呼吸道傳染病，人群普遍易感，其中尤以嬰幼兒多見，給嬰幼兒身體健康造成嚴重威脅。其臨床癥狀特征為陣發性痙攣性咳嗽，病程可遷延數月，常引起流行。家庭內成人患者和潛在感染者是兒童百日咳的主要傳染源。人是百日咳鮑特菌的唯一宿主，由于疫苗產生的抗體滴度隨著年齡的增長而降低，孕婦體內的抗體傳送給胎兒很少，因此嬰兒對百日咳鮑特菌的抵抗力弱，加上未達到疫苗接種年齡，導致小于6個月齡的嬰兒百日咳的發病率明顯較其他年齡組高。近年來，兒童百日咳發病率逐年升高，并出現一些新的流行特征，已經成為兒科臨床醫師廣泛關注的傳染性疾病。百白破聯合疫苗的使用有效降低了百日咳的發病率及病死率。盡管疫苗接種率很高，近年來在許多發達國家和發展中國家百日咳的發病率呈持續上升趨勢，在一些國家和地區甚至出現暴發流行，百日咳再現的現象引起了廣泛關注[1]。百日咳再現的主要原因是疫苗接種對年長兒、青少年及成人覆蓋率不足，成人百日咳感染率增加，以致未接種疫苗或未完成全程疫苗接種的嬰幼兒發生百日咳感染[2]。自上世紀90年代以來，百日咳再現于疫苗覆蓋人群，產生這種現象的一部分原因是診斷技術的發展，醫生警惕性提高，人群免疫減弱和病原的選擇性。百日咳再現指出了建立快速、敏感、特異的實驗室診斷方法的重要性[3]。

2 百日咳的實驗室診斷現狀

目前對于百日咳的診斷主要是依靠臨床醫生對癥狀的判斷，但臨床醫生對非典型病例的認識存在嚴重不足。 包括我國在內，目前大多數國家和地區用于百日咳診斷的臨床標準中多數要求咳嗽時間至少在兩周以上，但是由于非典型病例的增多，部分病例會因此延誤診斷。因此，對于這些不典型的百日咳感染，尤其是青少年和成年人的隱性感染，需要結合可靠的實驗室診斷方法來幫助確診[4]。

百日咳的主要實驗室診斷方法包括細菌培養法、免疫學方法和基因檢測方法。尤其對于癥狀不典型的百日咳感染患者，實驗室診斷方法是確診百日咳感染的重要手段。傳統的細菌培養法雖然是診斷百日咳的金標準，但是存在培養時間長、陽性率低等缺點。本法檢測百日咳鮑特菌特異度高，但是靈敏度受到標本運送條件、標本質量、病程和抗菌藥物等多種因素限制。免疫學檢測是對病原微生物抗原抗體的檢測，容易出現假陽性。其中以PCR為基礎的百日咳基因檢測方法的靈敏度好，陽性率高，并且受抗菌藥物使用的影響小。但是百日咳普通PCR檢測方法還存在使用強烈致癌劑溴化乙錠作為染色劑、擴增時間長、依賴昂貴儀器、基層實驗室無法開展等一些不足。鑒于上述原因，研究新的快速、敏感、特異、便于操作的百日咳診斷技術就顯得十分必要。

3 LAMP技術概述

LAMP是一種新的核酸體外恒溫擴增技術[5]。LAMP技術主要通過一組特異性引物針對目的基因的6個特定區域，在恒溫擴增環境條件下(60～65 ℃)，依賴于一種具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，高效率(30～60 min)地擴增目標 DNA。LAMP產物的檢測可根據反應過程中產生的焦磷酸鎂白色沉淀，或在反應系統中加入熒光染料，可以用肉眼或實時檢測儀器判斷擴增與否[6]。

與PCR技術相比，LAMP技術對標本前處理要求不高。有些病原體可以用簡單處理的標本作為模板，例如甲型流感病毒LAMP檢測試劑盒對標本處理要求是，只需把拭子標本在核酸提取試劑中進行簡單攪拌即可完成標本中DNA的抽取。甚至有研究顯示，省略標本DNA提取步驟，不會影響LAMP擴增的靈敏度[7-8]。LAMP方法不僅對核酸提取要求低，而且靈敏度高，可從極微量的標本中擴增出目的基因，其最低檢測限是傳統PCR的10～100倍[9-10]。

雖然LAMP技術是一種快速、簡便的核酸擴增方法，但該技術在結果呈現方面仍然表現出不足和缺陷。該方法在檢測過程的某些環節存在很多提升空間，LAMP擴增產物的可視化成為近年的研究熱點。LAMP-橫向流動試紙條(LFD)技術是LAMP與LFD相結合的一種新技術，該技術將核酸恒溫擴增和可視化試紙條檢測有機地結合，使 LAMP 擴增產物現場檢測可視化[11]。檢測過程中加入特異性探針，不僅提高了檢測的特異度，而且擺脫了對檢測儀器設備的依賴，而無需EB等有毒試劑。LFD技術結合了嚴格的堿基互補配對原則、抗原抗體反應的高特異度和PCR的高靈敏度，并融合了免疫層析技術和分子生物學手段[12]。

LAMP-LFD技術在保留了LAMP優點的基礎上，在產物可視化檢測方面又邁進了一步，使檢測過程更加便捷，摒棄了昂貴儀器的依賴，大幅度降低了從核酸擴增到結果展示過程中的儀器成本。LAMP-LFD技術在檢測的靈敏度和特異度方面具有特殊優點，其作為一種終極模式在微生物的即時檢驗方面具有無與倫比的優勢。目前也有將LAMP-LFD技術用于麻疹病毒檢測的報道[13]。

4 LAMP在百日咳檢測中的應用研究

自LAMP技術問世以來，以其檢測的快速、敏感、低設備依賴性等優點在微生物檢測方面得到了廣泛應用。隨著分子生物學的發展，LAMP技術不斷應用于百日咳鮑特菌基因快速檢測，這些報道大多針對百日咳基因的插入序列IS481、百日咳毒素(PT)和目的基因BP485基因等片段。

BROTONS等[14]建立了檢測百日咳鮑特菌基因的LAMP方法。該實驗中LAMP擴增可在12～30 min內完成，檢測限可達2 CFU/mL，是實時PCR的2.5倍。用這個方法檢測百日咳的靈敏度為96.55%，特異度為99.46%，線性范圍為10～105CFU/mL，適合用于百日咳鮑特菌的即時檢驗。KAMACHI等[15]建立了一種檢測百日咳鮑特菌的LAMP方法，其檢測結果與傳統PCR一致，且該LAMP法特異度高，與其他種屬鮑特菌無反應。NAKAMURA等[16]用LAMP方法檢測一名出生28 d女嬰鼻咽拭子和氣管吸出液中的百日咳鮑特菌基因，這兩種標本均發現擴增信號。由于嬰幼兒百日咳的臨床癥狀不典型，LAMP方法對于嬰幼兒百日咳的診斷具有不可替代的優勢。

5 展 望

綜上所述，LAMP法檢測百日咳鮑特菌核酸，準確快速、操作簡便、無需昂貴的實驗設備、易于推廣使用。隨著LAMP技術不斷優化，其在產物的可視化檢測方面也日趨完善。相信LAMP-LFD技術在百日咳的即時檢驗方面將會有廣闊的應用前景。