植物油DNA提取和基因檢測的研究進展

◎ 李曉萌

（沈陽食品檢驗所微生物檢驗室，遼寧 沈陽 110000）

植物油屬于酯類物質(zhì)，主要由高級脂肪酸、甘油組成，常溫狀態(tài)為液態(tài)。植物油在人們生活中占據(jù)著不可替代的位置，而當今市場上植物油摻假、轉(zhuǎn)基因植物油標識混亂的情況，極大地影響了消費者權益，同時也威脅到了人們的身體健康[1]。為此，需要采取有效措施了解植物油轉(zhuǎn)基因成分及真實性，常規(guī)方法主要包括儀器分析、理化分析等，隨著分子生物學的發(fā)展，也可以此為基礎，采取新的基因檢測方法。DNA熱穩(wěn)定性、酸堿耐受性良好，為分子生物學檢測提供了可能。

1 植物油DNA提取

1.1 提取步驟

植物油DNA提取中，主要步驟包括裂解、純化等。通過裂解將DNA在裂解體系中釋放，通過純化使有利DNA和裂解體系中鹽、多糖、蛋白質(zhì)等其他成分進一步去除分離[2]。在裂解過程中，可以采用機械裂解、酶裂解、化學裂解等方法。純化當中，使用氯仿、酚等作為有機溶劑，經(jīng)過抽提后將DNA沉淀出，使用磁珠、吸附樹脂等吸附DNA，然后將DNA洗脫。在DNA提取的不同方法中，主要差異存在于裂解、純化等過程，可以對裂解、純化方法加以優(yōu)化，進而使植物油DNA提取效率提升。不同于其他物質(zhì)，植物油屬于高度深加工純化產(chǎn)品，含有較高的油脂類物質(zhì)，嚴重破壞DNA，并大幅降低含量。所以，植物油DNA提取中，使用乳化法等方法在裂解前需要做好前處理，將其中油類物質(zhì)去除，將更多殘留DNA分離出。

1.2 提取方法

植物油DNA提取中，常用方法包括十二烷基磺酸鈉（SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等。SDS是一種陰離子去污劑，可在高溫下，促使細胞裂解和蛋白質(zhì)變性，結合蛋白質(zhì)、糖類等形成多重物，分離DNA和其他成分。可提升鹽濃度，降低溫度，以降低SDS多重物溶解度，沉淀多糖、蛋白質(zhì)，進而純化DNA。SDS方法是當前提取DNA常用的方法之一，操作簡單，成本較低，提取DNA完整性較好。CTAB是一種陽離子去污劑，也可和DNA形成多重物。在高鹽濃度下，多重物溶解，低鹽濃度下，溶解度降低，產(chǎn)生沉淀，多糖、蛋白質(zhì)仍在溶液中溶解，采取離心操作，分離多糖、蛋白質(zhì)與DNA多重物，進而純化DNA，將CTAB去除得到DNA[3]。CTAB在裂解液中作為主要成分，能夠?qū)毎呀猓㈦s質(zhì)成分去除。對裂解液成分優(yōu)化，能夠提高植物油DNA提取效率。

2 植物油基因檢測

2.1 普通PCR法

PCR即聚合酶鏈式反應，是一種先進的分子生物學技術，能夠在體外擴增微量特定DNA片段。常規(guī)PCR檢測中，包括PCR擴增、電泳分析等流程，在食物有轉(zhuǎn)基因成分檢測，摻假檢測中已經(jīng)得到廣泛應用。例如，相關研究中采用PCR法對市面上10種精煉大豆油DNA進行檢測，得出結果和樣品標識相同。對2種大豆油DNA進行PCR擴增，結果表明轉(zhuǎn)基因而大豆內(nèi)源基因中，都產(chǎn)生了擴增條帶，符合產(chǎn)品標識，證明PCR可以對植物油外源基因加以檢測[4]。普通PCR方法成本低、效率高，對儀器沒有太高要求，但在目標基因擴增后，需要采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，由于檢測樣品中，DNA含量通常較低，條帶亮度不足，對最終結果產(chǎn)生影響。同時，電泳操作中使用有毒試劑，可能危害人體健康，因而該方法實際應用有所限制。

2.2 多重巢式PCR法

巢式PCR方法，是聚合酶鏈式反應的變異形式，對完整片段擴增，運用了2對PCR引物。其中，第一對引物擴增片段，類似于普通PCR，第二對引物，叫做巢式引物，在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部結合，進而相比第一次擴增，縮短第二次PCR擴增片段。在第一次擴增形成錯誤片段后，第二次就幾乎不會在錯誤片段擴增。這種方法在應用中，極大地提高了擴增的靈敏度、特異性。在多重PCR方法中，能夠同時對不同位點基因擴增，進而提升基因檢測效率。

2.3 實時熒光定量PCR法

實時熒光定量PCR方法，是對普通PCR方法加以改進，將熒光基團加入反應體系，通過積累熒光信號，實時監(jiān)控PCR反應進程。對比標準曲線，定量檢測位置模板。在相關研究中，對市面上出售的品牌大豆油DNA實時熒光定量PCR檢測，檢測結果均呈陽性，符合產(chǎn)品標識。還有研究中，也選擇了10種植物油，采用實時熒光定量PCR方法檢測，結果表明6種植物油擴增結果為陽性，符合產(chǎn)品標識[5]。另外，采用實時熒光定量PCR方法，檢測花生油、棕櫚油、大豆油混合植物油，結果證實能夠?qū)χ参飪?nèi)源基因進行檢測。在植物油基因檢測中，實時熒光定量PCR方法，特異性強、靈敏度高、再現(xiàn)性好，相比于普通PCR方法，減少了瓊脂糖凝膠電泳鑒定的過程，避免了交叉污染，但對儀器條件提出更高要求。

2.4 環(huán)介導等溫擴增法

環(huán)介導等溫擴增法是一種DNA擴增處理的新型方法，可以6個靶基因區(qū)域為基礎，分別對4種特異引物加以設計。基于鏈置換DNA聚合酶作用，60～65 ℃恒溫條件下，對DNA片段恒溫擴增。在實際檢測中，有恒溫擴增操作、產(chǎn)物檢測操作等流程。環(huán)介導等溫擴增法是DNA恒溫擴增的重要方法，擴增過程一般在恒溫水浴鍋當中進行。在恒溫條件下，環(huán)介導等溫擴增法和普通PCR方法相比，能夠提升2～5個數(shù)量級。同時，該方法對儀器條件要求不高，具有較強的特異性，操作比較簡便，檢測成本可控，判斷結果難度較低。但在該方法的實際應用中，引物設計難度通常較大，復雜度較高。在擴增產(chǎn)物處理中，可能導致DNA污染的情況。另外，檢測中也有一定機率出現(xiàn)假陰性的結果，需要加以注意。

3 結語

在植物油質(zhì)量檢測中，DNA提取質(zhì)量將對基因檢測效率產(chǎn)生直接影響。基于植物油中DNA含量少、完整度低的特點，對傳統(tǒng)方法加以改進，采取新的DNA提取方法，提升DNA純度。進而采用改進PCR方法進行基因檢測，降低成本，提高靈敏度和特異度，取得更理想的檢測效果。

[1]蔡翠霞，肖維威，吳慧慧，等.植物油DNA的高效提取方法研究[J].中國油脂，2014，39（1）：69-72.

[2]李向麗，譚貴良，劉 垚，等.實時LAMP法快速檢測食用植物油中的轉(zhuǎn)基因成分CaMV-35S[J].現(xiàn)代食品科技，2014，30（2）：244-248.

[3]劉 欣，祝長青，王毅謙，等.大豆轉(zhuǎn)基因檢測中DNA提取方法的比較研究[J].食品科學，2013，34（4）：199-203.

[4]蔣立斌，張云生，楊 華，等.綿羊外周血中游離DNA提取及SRY基因檢測[J].新疆農(nóng)業(yè)科學，2014，51（7）：1342-1346.

[5]劉瑞霞，楊玉珍，王國霞，等.油用牡丹‘鳳丹’葉片DNA提取方法研究[J].生物技術世界，2015（6）：44-45.