兒童心肌病的基因檢測:我們究竟能從中獲益多少?

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇 南京 210019)

心肌病是一類嚴重威脅兒童健康和生命的心臟疾病，根據(jù)解剖和病理生理分型，可以分為擴張型心肌病(DCM)、肥厚型心肌病(HCM)、限制型心肌病(RCM)、致心律失常型右心室心肌病(ARVC)和左心室致密化不全(LVNC)等多種類型[1-2]。與成人相比，兒童心肌病在病因和臨床表現(xiàn)等方面更加復(fù)雜，除了原發(fā)性心肌病外，還需注意遺傳代謝性心肌病，如溶酶體病、線粒體心肌病(神經(jīng)肌病)等。近年來，隨著現(xiàn)代分子遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，心肌病的遺傳學(xué)研究取得了巨大進展，并促進了人們對心肌病診治模式理念的更新。目前，開展心肌病的基因檢測、探索心肌病的精準診斷以指導(dǎo)治療和危險分層管理，正逐漸被大家所認識和重視[3-6]。但如何在基因測序后獲得的海量信息中識別出真正的致病突變，正成為我們面臨的新的挑戰(zhàn)，我們究竟能從中獲益多少，值得我們認真思考。

1 兒童心肌病的遺傳基礎(chǔ)

1.1 HCM

HCM約占兒童心肌病的26%～42%，以常染色體顯性遺傳為主，家族性和散發(fā)性均有報道，兩者具有相同的遺傳因素。HCM遺傳異質(zhì)性強，可以存在不完全外顯，但外顯率隨年齡增長而增加。目前發(fā)現(xiàn)的HCM致病基因有20多個，其中絕大部分突變位于肌小節(jié)蛋白(粗肌絲和細肌絲)基因，因此HCM也被稱作“肌小節(jié)病”[7-10]。HCM相關(guān)基因主要有：β肌球蛋白重鏈基因(MYH7)和心肌球蛋白結(jié)合蛋白C(MYBPC3)基因、編碼粗肌絲蛋白基因[肌球蛋白重鏈基因MYH6、肌球蛋白輕鏈基因(MYL2、MYL3)]、編碼細肌絲蛋白基因[肌動蛋白ACTC、原肌球蛋白TPMl、肌鈣蛋T(TNNT2)、肌鈣蛋白I(TNNI3)、肌鈣蛋白C(TNNCl)]及裝配蛋白基因(肌聯(lián)蛋白TTN)。最近有報道在散發(fā)性HCM患者中發(fā)現(xiàn)了Z蛋白相關(guān)基因、鈣離子相關(guān)蛋白基因和NEXN基因突變，但在人群中的突變頻率低。

1.2 DCM

與HCM相比，DCM的病因更復(fù)雜，診斷原發(fā)性DCM，需排除炎癥性心肌病、心動過速性心臟病及各種繼發(fā)性因素。DCM有多種遺傳方式，包括常染色體顯性遺傳、染色體隱性遺傳、X連鎖和線粒體遺傳等方式，其中以常染色體顯性遺傳為主。目前發(fā)現(xiàn)的DCM致病基因約30多個，包括心肌肌節(jié)蛋白基因、Z盤蛋白基因、細胞骨架蛋白基因以及鈣調(diào)控蛋白基因[11-13]，主要有LMNA、MYH7、TNNT2、SCN5A、DES、MYBPC3、TNNI3、TPMI、ACTC、PLN、LDB3以及TAZ等基因。近年來的測序發(fā)現(xiàn)DCM患者中存在較高頻率的TTN基因突變[14]，但功能研究發(fā)現(xiàn)TTN可能發(fā)揮了基因修飾的作用。DCM某些特定的表型與特定的基因突變有關(guān)，如伴有傳導(dǎo)障礙的DCM多數(shù)與核纖蛋白基因(LMNA)或SCN5A基因突變有關(guān)[15]；而伴隨骨骼肌病變的DCM通常表現(xiàn)為X連鎖遺傳，多與肌營養(yǎng)不良蛋白(DMD)基因以及TAZ基因的變異有關(guān)。相對于HCM，DCM病人中候選基因突變檢出率較低，不少病人存在多個基因的復(fù)合雜合突變，也存在不完全外顯，是否與疾病相關(guān)還有待研究。

1.3 RCM

與DCM和HCM相比，原發(fā)性RCM發(fā)病率最低，但進展快、預(yù)后差，尤其是兒童RCM，確診后平均生存期僅為2年。筆者診治的10例RCM患兒，大部分死于確診后1年。目前RCM發(fā)病機制仍不清楚，散發(fā)性RCM和家族性RCM均有報道，提示遺傳因素可能發(fā)揮重要作用。近年來，通過對RCM患兒測序發(fā)現(xiàn)了較高頻率的肌節(jié)蛋白基因(MYH7、TNNT2、TNNI3)突變，此外也發(fā)現(xiàn)了DES、TTN基因突變，提示肌節(jié)蛋白基因突變可能是RCM的重要遺傳基礎(chǔ)[5,16-19]。DES基因突變導(dǎo)致的RCM，多伴有高度房室傳導(dǎo)阻滯或骨骼肌疾病。

1.4 ARVC

ARVC常以左束支阻滯的室性心動過速為特征，隨著疾病的進展出現(xiàn)心力衰竭。ARVC發(fā)病與遺傳關(guān)系密切，多呈常染色體顯性遺傳，30%～70%的ARVC患者與橋粒蛋白基因突變有關(guān)(如JUP、DSP、PKP2、DSG2及DSC2基因)，少數(shù)與非橋粒蛋白(TMEM43和TGFβ3)基因突變有關(guān)[3-5,20]，大多數(shù)基因具有顯著等位基因異質(zhì)性。兒童ARVC與成人ARVC具有相同遺傳基礎(chǔ)，但病例報道不多。

1.5 LVNC

LVNC發(fā)病機制尚不清楚，近50%的病例有家族史，其遺傳方式多樣化，包括常染色體顯性或者隱形遺傳、X連鎖以及線粒體基因遺傳等。目前發(fā)現(xiàn)約有15個基因參與了LVNC的發(fā)生，其中包括TAZ、ZASP/LBD3、LMNA以及DTNA等，同時還與MYH7、ACTC、TPM1、MYBPC、TNNT2、FKBP-12以及SCN5A基因的突變有關(guān)[3-5]。部分線粒體病，例如BARTH綜合征等可以合并心肌致密化不全。

1.6 遺傳代謝性心肌病

心肌病病兒，尤其嬰兒期起病者，一定要注意遺傳代謝性心肌病可能。此類患兒除心肌病變外，還可伴有血生化異常(肌酸激酶和肝酶升高、低血糖、高血脂、乳酸升高等)，另外還伴有代謝性酸中毒、肝臟腫大、神經(jīng)肌肉受累等。相對于原發(fā)性心肌病，此類患兒通過基因檢測對早期診斷意義重大，因為部分代謝性心肌病經(jīng)過針對性治療有可能逆轉(zhuǎn)、阻止或延緩心肌病進展，改善預(yù)后[6,21]。

合并心肌肥厚的代謝性疾病主要有糖原累積病Ⅱ型、DANON病、PRKAG2心臟綜合征等。糖原累積病Ⅱ型，又稱POMPE病，常染色體隱性遺傳病，因GAA酶基因突變引起酸性α-1-4葡萄糖苷酶缺乏導(dǎo)致糖原分解障礙，臨床可表現(xiàn)為血清CK明顯增高、肌肉無力、心肌肥厚等，嬰兒期發(fā)病多以心肌肥厚為主要表現(xiàn)。DANON病是一種X連鎖顯性遺傳性溶酶體病，由編碼Ⅱ型溶酶體相關(guān)膜蛋白(LAMP2)的基因突變導(dǎo)致糖原代謝障礙，臨床表現(xiàn)與DANON病類似，以肥厚型心肌病、骨骼肌病和智力障礙三聯(lián)征為主要表現(xiàn)。PRKAG2心臟綜合征為常染色體顯性遺傳，由編碼AMP激活蛋白激酶r-2調(diào)節(jié)亞單位PRKAG2基因缺陷導(dǎo)致，臨床表現(xiàn)為預(yù)激綜合征、進展性傳導(dǎo)系統(tǒng)疾病和心肌肥厚。

對兒童DCM合并血生化異常者，需注意脂肪酸代謝障礙(如肉堿缺乏癥、肉堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶Ⅱ型缺乏癥等)、氨基酸和有機酸代謝障礙(丙酸血癥、甲基丙二酸血癥、β-酮硫解酶缺乏癥等)、溶酶體病、過氧化物酶體異常等遺傳代謝性疾病；合并神經(jīng)系統(tǒng)異常(智力發(fā)育落后、矮小、驚厥、共濟失調(diào)等)，要考慮線粒體病可能。肉堿缺乏癥，是脂肪酸氧化代謝病的常見病種，呈染色體隱性遺傳，由于細胞膜上肉堿轉(zhuǎn)運體OCTN2缺乏，從而導(dǎo)致肉堿攝取障礙及由尿液中大量流失而引起體內(nèi)肉堿缺乏，影響脂肪酸代謝，多在2歲以前出現(xiàn)癥狀，臨床表現(xiàn)為低酮性低糖血癥、RYE綜合征、昏迷、DCM、LVNC或者HCM、心律失常等。

法布里病(FABRY病)，為X連鎖隱性遺傳，主要為男性發(fā)病，女性雜合子表現(xiàn)輕微或無癥狀，由α-半乳糖苷酶缺乏導(dǎo)致其降解底物三糖苷神經(jīng)酰胺在溶酶體內(nèi)大量沉積所致，可表現(xiàn)為發(fā)作性肢體疼痛與四肢蟻爬感、皮膚血管角質(zhì)瘤、腎臟病變，心臟主要表現(xiàn)為RCM或HCM表型。BARTH綜合征是一種主要見于男孩的線粒體疾病，臨床特點為肌無力、生長遲緩、周期性血清中性粒細胞減少和尿中3甲基戊烯二酸增多，心臟受累多表現(xiàn)為DCM或LVNC，也有呈HCM表現(xiàn)。此外，黏多糖病和先天性糖基化病，也可導(dǎo)致HCM或DCM。

2 如何開展兒童臨床心肌病基因檢測

既往多采用候選基因測序法，針對某一特定心肌病表型，檢測1個或幾個相關(guān)基因，費時、費力，突變陽性率低。即使基因檢測陰性，也不能排除其他基因變異致病的可能。隨著高通量二代測序技術(shù)的出現(xiàn)，人們設(shè)計出各種包含上百種心肌病相關(guān)基因的芯片，從而可以進行快速檢測。

目前臨床基因檢測已受到社會和臨床醫(yī)師的廣泛重視，出現(xiàn)了眾多提供遺傳檢測服務(wù)的生物信息公司，少數(shù)大的醫(yī)療中心可以自行進行測序研究。根據(jù)需要，有多種檢測策略可供選擇，如HCM患兒合并肝臟腫大、血清CK升高、外周血白細胞GAA酶活性下降，可以直接選擇單方向疾病檢測方法檢測GAA基因，以進一步確診是否為POMPE病；對大多數(shù)心肌病病人，可選擇涵蓋目前已知與遺傳性心肌病相關(guān)的所有基因的綜合檢測panel進行檢測；如從科研考慮，可以選擇全外顯子測序，對涵蓋目前人類已知2萬個基因進行檢測；對某些合并神經(jīng)肌肉病變的心肌病患兒，除進行外顯子組二代測序外，還需考慮拷貝數(shù)變異(CNV)和線粒體基因檢測。在先證者發(fā)現(xiàn)陽性突變后，進一步對家系成員進行一代測序驗證。

為提高分析能力，盡可能收集先證者家系成員資料，首先對先證者進行二代測序，發(fā)現(xiàn)可疑突變后，再進一步對家系成員進行一代測序驗證；也可以直接選擇對先證者核心家系Trio進行二代測序，再驗證其他家族成員，這樣能大大提高突變檢測效率，但費用相對較高。

3 開展兒童心肌病基因檢測的臨床意義及精準診治研究

由于兒童心肌病病因復(fù)雜，尤其是HCM和DCM，有時為多系統(tǒng)疾病的一部分，臨床表現(xiàn)隨病程發(fā)展而改變，僅依據(jù)剛起病時的臨床特征難以診斷，開展臨床診斷相對困難。傳統(tǒng)診斷模式一般根據(jù)臨床表現(xiàn)、實驗室檢查作出診斷，但對于部分早期臨床表現(xiàn)不典型、無法確定病因的患兒，可以通過基因檢測實現(xiàn)精準診斷。基因檢測對合并心肌病變的遺傳代謝性疾病的診斷有重要意義，因為此類疾病治療方法與原發(fā)性心肌病差異巨大。如FABRY病，是GLA基因突變所致的一種X-連鎖隱性遺傳病，可通過補充α-半乳糖苷酶或轉(zhuǎn)基因治療。筆者近年來通過基因檢測確診了不少罕見的代謝性心肌病，如POMPE病、DANON病、先天性糖基化病(合并DCM)等，很好地指導(dǎo)了遺傳咨詢；其中對1例有特殊體征的“DCM”患兒通過基因檢測發(fā)現(xiàn)IDUA基因突變，確診為黏多糖病Ⅰ型，為IDUA基因突變引起α-L-艾杜糖醛苷酸酶缺乏，骨髓移植是治療該病的主要手段。

目前世界范圍內(nèi)的研究者們都在利用遺傳技術(shù)探索心肌病的精準治療之路，2017年美國心臟協(xié)會(AHA)向世界各地的研究者開放了他們的精準醫(yī)療平臺。對心肌病致病基因功能研究發(fā)現(xiàn)，突變主要是通過改變心肌纖維最大張力、對鈣離子敏感性及能量代謝異常等影響心肌重構(gòu)。如突變引起心肌細胞對鈣離子敏感性增加、心肌最大張力和心肌收縮力增強，導(dǎo)致舒張功能的障礙，表現(xiàn)為HCM或RCM；相反，如突變引起心肌細胞對鈣離子敏感性減弱、心肌最大張力和心肌收縮力下降，導(dǎo)致收縮功能障礙，表現(xiàn)為DCM。因此，開發(fā)高選擇性的心肌球蛋白調(diào)節(jié)劑以及鈣離子調(diào)節(jié)劑(增敏劑/減敏劑)有可能成為新的治療手段。2017年8月MyoKardia公司宣布其研制的肌凝蛋白抑制劑mavacamten(MYK461)在PIONEER-HCM的二期臨床試驗顯示能顯著改善HCM舒張功能，證實MYK-461有潛力作為一種重要的新的治療HCM的制劑[22]。

4 大數(shù)據(jù)下心肌病基因檢測的思考

陳潤生院士認為精準醫(yī)學(xué)的核心“就是組學(xué)大數(shù)據(jù)和醫(yī)學(xué)的結(jié)合”。二代測序的出現(xiàn)，讓我們從測序技術(shù)時代，步入大數(shù)據(jù)分析時代，但也帶來了新的挑戰(zhàn)。一次基因組檢測可以得到上百萬個突變，但致病突變可能只有一個，如何解決海量數(shù)據(jù)臨床級別分析成為關(guān)鍵。我們在臨床實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，遺傳代謝性心肌病陽性檢出率高，易于確診和解釋；而原發(fā)性心肌病，突變檢出率相對較低，且存在不同程度的不外顯率，不易解讀[23-24]。

HCM作為典型的遺傳性心血管疾病，并且是單基因心血管疾病中最為常見的疾病，最有可能實現(xiàn)精準醫(yī)療。DCM和其他分類心肌病病因復(fù)雜，相關(guān)基因眾多，不少患者為非肌節(jié)蛋白基因突變，有的患者攜帶不止一個相關(guān)基因突變，即攜帶了復(fù)合突變、雙突變甚至是三突變，數(shù)據(jù)不易解讀，遺傳診斷困難。攜帶多突變患者預(yù)后顯著差于單突變患者。

5 展望

近年來遺傳學(xué)技術(shù)的進步大大提高了我們識別兒童心肌病潛在病因的能力，但是由于兒童心肌病以散發(fā)為主，病因比較復(fù)雜，臨床表型異質(zhì)性強，疾病的進展、治療和預(yù)后很難預(yù)測。如何對海量的測序信息和臨床信息進行有效分析，成為我們新的挑戰(zhàn)，也是開展精準診治的關(guān)鍵。借助大數(shù)據(jù)技術(shù)，建立兒童心肌病的多中心聯(lián)合研究，通過隨訪數(shù)據(jù)與臨床數(shù)據(jù)、遺傳檢測數(shù)據(jù)的結(jié)合，深度分析兒童心肌病的發(fā)病因素及遺傳背景、臨床表型、診斷、用藥、疾病演變及預(yù)后之間的關(guān)系，探索兒童心肌病的精準診治，建立一套規(guī)范合理、易推廣的兒童心肌病的長期管理方案，對提高我國兒童心肌病的診治水平意義重大。