哺乳動物妊娠中miRNA的作用

韓志強,宋興超,王海軍,賈 赟,趙家平,趙全民,邢秀梅,徐 超*

(1.中國農業科學院特產研究所，農業部特種經濟動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，吉林省特種經濟動物分子生物學省部共建國家重點實驗室,長春 130112； 2. 吉林農業大學，長春 130118；3. 吉林省野生動物救護繁育中心，長春 130119； 4.遼寧出入境檢驗檢疫局技術中心,大連 116001)

miRNA是一類小的非編碼RNA，廣泛存在于動物的血清、血漿、唾液、初乳、腹膜液、精液、卵泡液等生物體液中，并在人和許多動物的生理(懷孕)和病理過程中起著關鍵作用。miRNA具有調節基因表達的功能，在基因表達中起著“微調”而不是“開關”的作用，并與多種細胞的代謝、分化、增殖和凋亡過程有關[1]。1997年Lo等[2]證實了母體血液中存在著部分的胎兒游離核酸，2000年Poon等[3]在母體血漿中檢測到游離胎兒RNA，2008年Chim等[4]在人體血液中檢測到妊娠特異性miRNA。同一物種血清中的胎盤miRNA水平在個體之間具有高度相似性[5]。由于血漿中存在的miRNA比mRNA更穩定[4]，所以母體血漿中胎盤miRNA的含量可作為監測胎盤基因調控的重要依據。除了血液，胎盤亦是miRNA高度富集的器官之一[6]，動物胎盤功能和動物妊娠與胎盤中的特異性miRNA簇具有十分重要的關系[7-9]。miRNA參與胚胎著床前子宮內膜的發育[10]，調節炎癥反應及免疫耐受相關基因在懷孕開始與維持過程中的表達。

1 妊娠相關的miRNA簇

目前為止，已報道了600余種miRNA在人體胎盤的動態表達。胎盤miRNA可通過3個miRNA簇內的多種miRNA來表達，其中包括C14MC簇(chromosome 14 miRNA cluster, C14MC)、C19MC簇(chromosome 19 miRNA cluster, C19MC)以及miR-371-3簇[11-12]。特別是懷孕期間，妊娠相關胎盤miRNA 簇的表達量在不斷發生著變化[11, 13]。血液中的胎盤miRNA 主要來源于絨毛滋養層。miRNA 簇廣泛存在于母體血液循環中，所以對動物妊娠診斷來說具有極大的應用潛力。

1.1 C14MC簇

C14MC又被稱為Mirg簇[14]、miR-379/miR-410簇或miR-379 / miR- 656簇[15]，包含約52個miRNA基因(產生63個成熟miRNA)[11-12, 16]。C14MC簇在真哺乳亞綱物種中是保守的，僅由母本遺傳的等位基因(父本等位基因被甲基化)表達，并且主要在發育中的胚胎(頭和軀干)和胎盤組織表達，也在滋養層細胞高度表達[17]。C14MC簇具有促進哺乳動物胎盤進化的作用[15]。

1.2 C19MC簇

C19MC簇位于19號染色體上，是迄今為止人染色體上最大的miRNA基因簇之一。C19MC屬靈長類動物的特異性miRNA家族，大鼠、小鼠以及狗的體內并沒有發現該miRNA簇的同源物[18]。C19MC簇包括了46個miRNA(產生58個成熟miRNA)[17]。與C14MC簇類似的是，C19MC簇也位于印跡基因內，與C14MC相反的是，C19MC受17.6 kb上游CpG啟動子區甲基化控制，僅由父本遺傳等位基因表達[19]。印跡基因在細胞分化和命運的調控中具有重要作用，并且它們大都僅在胚胎期或胎盤組織中表達。C19MC的表達主要受生殖系統和胎盤的影響[13]。研究表明，C19MC簇在胚胎發育中具有重要的作用，妊娠早期許多外周體液中C19MC簇miRNA表達量升高[20]。

1.3 miR-371-3簇

miR-371-3簇主要由hsa-miR-371a-3p、hsa-miR-372和hsa-miR-373-3p產生的6個成熟RNA組成的。miR-371-3簇共享著相同種子序列“AAG UGC”，并且該共享相同種子序列miRNA超家族還包括小鼠同源物簇miR-290-295[9]。miR-371-3簇位于與C19MC簇下游約25 kb的1 050 bp區域內[21]。與C14MC簇和C19MC簇類似的是僅在哺乳動物中高度保守，并且在胎盤中優先表達[22]。現已證明，miR-371-3簇是調節細胞增殖和凋亡必需的miRNA[23]，因此對胚胎發育具有重要的作用。

對哺乳動物中人miRNA分析顯示，C19MC簇、C14MC簇和miR-371-3簇在胎盤組織中高度表達，并且其表達隨胎齡變化而變化[24]。C14MC簇和C19MC簇的水平在整個懷孕期間也不斷地發生變化。C14MC簇在第一孕周的滋養層細胞中高度表達，但在妊娠中期減少。與C14MC簇相反，C19MC簇在妊娠前期表達較低，但在妊娠末期高度表達。妊娠終止后，受胎盤影響C14MC簇和C19MC簇妊娠相關的miRNA表達水平顯著下降[11, 25]。胚胎與血液中的miRNA的變化反映并維持著動物機體妊娠進程，以miRNA鑒定為基礎進行妊娠研究會是未來發展的大趨勢。

2 miRNA與早期妊娠診斷

早期妊娠診斷是哺乳動物繁殖管理的重要環節，其對于提高動物妊娠率尤為重要[26]。循環miRNA則對妊娠診斷具有潛在的預測性、特異性、敏感性，并且能以非侵入性的方式獲得，其檢測效率也相對較高[27-28]。Ioannidis和Donadeu[29]首次確定了牛早期妊娠期間血漿中miRNA的變化水平，發現了 10個 最豐富的miRNA，即bta-miR-133a、bta-miR-486、bta-miR-22-3p、bta-miR-19、bta-miR-191、bta-miR-423-5p、bta-miR-10b、bta-miR-142-5p、bta-miR-27b和bta-miR-30d，占總miRNA量的61%，其中，懷孕母牛第16天miR-133a表達水平比同期非懷孕小母牛高出7.4倍，并發現在懷孕16～24天期間miR-26a水平升高2倍以上。Ioannidis和Donadeu[30]進一步研究發現，最早可在牛妊娠第8天 檢測到miR-26a的水平明顯增加，另外，第16天 與第8天相比miR-101的水平也趨于升高。近期在豬和羊的研究中也發現，妊娠第20天時miR-26a在受孕卵巢中的表達水平出現增加[31-32]。在懷孕羊中還發現，miR-30c、miR-132、miR-379、miR-199a-3p和miR-320也出現差異表達。另有研究提出，bta-mir-140可作為早期妊娠診斷的分子生物標志物[33]，這為研究者們通過miRNA進行早期妊娠診斷提供了新的依據。近年來，諸多學者提出通過對奶中miRNA 譜高通量測序分析進行妊娠診斷也具有十分重要的意義[34]。miRNA廣泛存在于血液[35]、唾液[36]、尿[37]和牛奶[38]等多種動物體液中，這些體液中的miRNA將來均有望成為研究妊娠診斷理想的分子標志物。

3 miRNA與妊娠相關疾病的關系

miRNA除了在正常妊娠中發揮作用，其動態調節基因表達的能力也有助于妊娠相關病癥的診斷，包括先兆子癇、異位妊娠、復發性流產、早產和胎兒宮內發育遲緩等[39]。雖然懷孕期間miRNA作為標志物的鑒定仍處于初期階段，但現在已經篩選出了許多具有研究意義的miRNA。現階段對于除人外的哺乳動物妊娠疾病與miRNA研究較少，以下主要討論人常見懷孕異常引發的疾病與miRNA 特征性關系。

3.1 miRNA與先兆子癇的關系

先兆子癇(preeclampsia，PE)是指在哺乳動物妊娠后半期、分娩期或分娩后期出現高血壓、蛋白尿或其他系統疾病的一種妊娠相關綜合征[40]。PE在人中發病率高達8%[41],然而PE在妊娠早期癥狀并不明顯，很難進行診斷，因此尋找某種鑒定早期PE的方法至關重要。有研究表明，miRNA可參與PE的發病機制[42]。Ishibashi等[43]對人正常胎盤和PE胎盤之間的miRNA進行大規模高通量測序，篩選出了先兆子癇胎盤中顯著上調的22種miRNA，為研究先兆子癇提供了有力依據。Yang等[44]研究發現，PE患者妊娠前3個月miRNA表達量有15個 上調，7個輕度下調。其中嚴重PE患者血漿中的miR-24、miR-26a、miR-103、miR-130b、miR-181a、miR-342-3p和miR-574-5p表達量升高。Loux等[45]在孕馬體內發現，與PE有關的miR-204b和hsa-miR-204表達上調。De Bem等[46]證明，妊娠奶牛血液中hsa-miR-26a水平增加與妊娠有關，這種miRNA與先兆子癇相關。先兆子癇的發生可能是由母體和胎兒-胎盤循環中的血管內皮功能障礙引起的，這種功能障礙會引起包括調節血管張力、膜轉運功能、內皮存活或增殖、血管生成和代謝途徑等相關miRNA表達量發生改變。

3.2 miRNA與異位妊娠的關系

異位妊娠(ectopic pregnancy，EP)是指孕卵在子宮腔外著床發育的異常妊娠過程，也稱“宮外孕”，孕婦發病率為1%～2%[47]。現階段EP檢測主要有兩種方法，一種是陰道超聲檢查，但是經陰道超聲不能準確地確定EP；另一種是通過檢測母體血清中的人絨毛膜促性腺激素(HCG)和孕酮濃度，然而，通過血HCG和孕酮濃度對EP的診斷方法易產生假陽性和假陰性結果[48]。因此尋求一種快速、準確鑒定異位妊娠的方法至關重要。Zhao等[48]為了尋找可以更準確、敏感地鑒定人的異位妊娠生物標志物，比較了發生自發流產(spontaneous abortion,SA)和正常妊娠(normal pregnancy,NP)的EP患兒血清樣本中妊娠相關miRNA的表達，結果顯示，EP或SA與NP相比，miR-517a、miR-519d和miR-525-3p的表達量較低，而miR-323-3p表達量明顯高于EP。Lu等[49]研究發現，SA和EP患者與正常孕婦相比，血清miRNA中的5種miRNA(miR-218、miR-233、miR-141、miR-873和miR-323)出現差異表達，并且miR-873作為單一標記具有最高的靈敏度，EP檢測率高達61.76%。雖然對于miRNA異位妊娠研究較多，但現階段利用miRNA來檢測異位妊娠還不成熟，還需進一步篩選特異性標志物，通過HCG和孕酮與miRNA結合評估可以提高miRNA 作為生物標志物的診斷性能，也可以提高異位妊娠的總體診斷效率。

3.3 miRNA與早產的關系

人早產(premature delivery，PTD)分娩的定義為在妊娠37周之前的分娩。對于除人外的哺乳動物來說，妊娠時間各有差異，因此對于早產的時間定義也有所不同。研究發現，PTD患者中miRNA出現了差異表達[50-51]。Enquobahrie等[50]發現，人早產與miR-210和mir-223的含量增加相關。Pineles等[51]進行了miRNA微陣列分析，發現人絨毛膜中的39個miRNA在術前和早產組之間相比出現差異表達，miR-338、miR-449、miR-136和miR-199a表達出現下降。Mayor-Lynn等[52]分析了人早產和正常胎盤之間的miRNA表達譜，發現了20種差異表達miRNA，在早產孕婦胎盤中miR-15b、miR-181a、miR-210、miR-296-3p、miR-483-5p和miR-493等許多miRNA出現差異表達。Gray等[53]則證實，人母體血漿中miR-223表達升高與自發性早產相關，并認為miR-223有望成為早期預測自發性早產的miRNA生物標志物。另外，懷孕早期外周血中miRNA的定量分析對自發性早產的敏感和特異性預測也具有較高價值[54]。

4 miRNA與母乳的關系

母乳中含有豐富的分泌型免疫球蛋白和雙歧因子，具有提高動物免疫力、促進動物生長、降低動物幼崽發病率和死亡率的作用，對于新生哺乳動物幼崽來說至關重要。miRNA與催乳素生成途徑相關，能夠參與乳汁合成的生理過程[55]。現在有超過1400種成熟的miRNA在人乳中表達[56]，人乳中還含有豐富的免疫相關miRNA[56-57]。牛乳中的一些miRNA與神經系統通路有關，并可能介導大腦發育，如miR-118-2靶向了神經系統中豐富的蛋白神經元跨膜蛋白[58]。人乳中的一些miRNA還具有組織特異性[59]，如miR-142-5p具有造血特異性[60]。人乳中miRNA還可能促進嬰兒特定器官和組織的發育。此外，牛乳中miRNA與牛奶代謝途徑相關，如let-7家族大量存在于牛奶中，參與了葡萄糖代謝，并可調節葡萄糖耐受量和胰島素敏感性[58-59, 61]。另外，有研究發現，miRNA-148a在人乳中高度表達，并且miRNA-148a在白血病中表達較少，由此可推測，母乳中miRNA-148a等miRNA可能對兒童白血病具有保護作用[62]。值得注意的是，牛乳成分(包括miRNA)的晝夜變化可能對幼畜胃腸晝夜節律性的建立和調整有益[59]。

5 展 望

眾多研究表明，miRNA與妊娠過程中的胚胎發育、妊娠疾病診斷及產后哺乳存在一定的關系。現階段miRNA參與妊娠的多數功能是通過表達模式推測的，但尚未在多數哺乳動物中進行細致的功能研究，并且大都是通過采取部分組織或體液進行檢測，并不一定能完全反映其在動物體內的正常生理水平。若miRNA作為懷孕功能驗證的診斷工具，其快速精確的診斷特點對妊娠來說是不可或缺的，未來將miRNA應有到妊娠診斷時要注重對其穩定性進行深入探究。隨著互聯網技術和生物學檢測手段的不斷發展，miRNA在哺乳動物妊娠過程中的調控功能也會逐漸明晰，必將助力于畜牧與醫藥行業的發展。