濃縮生長因子研究進展及其對犬貓疾病治療的作用

紀婷，趙天旭，夏楠，饒宇騰，高蕊，李婕，陳武

（1.北京農學院獸醫學中醫藥北京市重點實驗室，北京 102206；2.寵福鑫中西結合國際動物診療中心，北京102206；3.北京圣銘宬科貿有限公司公司，北京 100012）

1 進展

1984年，Assoion等人提取人血漿中的富血小板血漿（Platelet.rich plasma，PRP），發現其中含有多種生長因子：血小板衍生生長因子（PDGF）、轉化生長因子-β（TGF-β）、骨形成蛋白（BMPs）、血管內皮生長因子（VEGF）、類胰島素生長因子（IGF）、表皮生長因子（EGF）以及成纖維細胞生長因子 （FGF）等[1]，PRP即為第一代血小板濃縮物。但是，PRP的缺點是需要在牛凝血酶的作用下才能釋放出其中的生長因子，發揮其功能；而且釋放生長因子的持續作用時間短，對促進組織再生修復持續時間也相應較短[2]。

第二代的血小板濃縮物（Plasma-rich growth factors，PRF），是由Choukroun首次提出[3]。抽取患者的新鮮血液，經離心機離心分離制備得到粘稠狀富纖維蛋白凝膠。在此過程中，血小板被激活，同時釋放大量生長因子，從而起到止血和消炎的作用，更重要的是，可促進組織愈合及血管的生成。PRF與PRP相比較，PRF釋放生長因子的持續作用時間長，制備簡便，具有較強的抗拉力和撕扯能力，已廣泛地應用于口腔醫學領域[3]。

第三代血小板濃縮物（Concentrated growth factors，CGF），是由Sacco于2006年首先介紹[4]，是用特殊的離心機將靜脈血進行離心制備而來，無需加入添加劑，避免了異種抗原引起的潛在風險。與PRF相比，離心速度不同。CGF中的纖維蛋白凝塊更大更密集，在移植后其釋放生長因子的持續時間為7 d，生長因子更豐富，顯示了更好的再生性能和更多的功能性。對于臨床而言，其擁有更高的拉伸強度、粘合強度、抗凝血時間等。CGF具有可膜制性，通過壓縮可以表現為薄膜的形式，CGF凝膠壓制成膜后具有覆蓋、保護、屏障和促進愈合的作用，從而可以粘附于缺損區，因此可以促進軟組織及骨組織缺損區的組織愈合。已有研究表明，其在提高骨組織修復方面的效果令人滿意，并且能夠促進軟組織快速愈合，減少術后瘢痕形成[5]。在臨床中CGF可在種植、上頜竇提升、軟組織缺損、美容等方面應用，CGF在臨床上的使用形式多種多樣，如凝膠狀、膜狀、液體狀等[6]。對前兩代血液提取物富血小板血漿和富血小板纖維蛋白的研究發現，其促進組織缺損修復的作用主要依賴于其內含有的大量血小板生長因子、白細胞和纖維蛋白。對于PRP和富血小板纖維蛋白的超微結構已有文獻報道，但尚未發現對CGF的超微結構的研究報道。

2 CGF的制備、生物學特性及其作用特點

CGF的制備是由意大利塞法登特（Silfradent）公司繼第一代血小板富集血漿-PRP（platelet-rich plasma）后，研發出提取新一代濃縮生長因子的組織修復系統。

將患者的靜脈血放于Medifuge離心加速器（Silfradent，Italy）的轉筒中，設定制備CGF程序，即可得到CGF纖維網狀蛋白凝膠支架。其分為3層，最上層為血清，底層為紅細胞及血小板，中間纖維蛋白層即為CGF被分離出來存放于稀釋的抗菌溶液中，底層部分可以與混合生物材料及自體骨混合，用作填料。CGF單獨或與骨替代材料混合，放于缺損組織處，可以促進骨組織成骨，軟組織愈合[2]。制備過程中，由于特殊的變速離心使血小板激活，從而釋放出組織再生所需的各種生長因子：PDGF、TGF-β、BMPs、VEGF、IGF、EGF以及FGF等[7]。

血小板衍生物來源于自體血，避免了免疫排異反應，從根本上解決了疾病傳染的發生及移植成功率低的現狀，含有多種生長因子，集合了多種生長因子的多種作用，又可以發揮相互之間的相互作用，從而促進組織再生，傷口愈合，發揮抗感染能力。在臨床上CGF可以依據不同需求以膜狀、凝膠狀、液體狀的形式使用，且不用加入任何催化成分，更加簡便、安全，更適用于臨床的應用[8]。

3 CGF的質量保障及檢測方法與技術

Medifuge離心加速機制備出的濃縮生長因子，可用酶聯免疫試劑盒測定CGF中含有TGF-β1、IGF-1、VEGF-A、PDGF-BB、FGF、BMPs-2、EGF和骨保護素等活性因子[9]。陳飛等[10]經過實驗研究制備1 d后TGF-β1和VEGF在CGF凝膠層析出液中的濃度分別約為其在上清層濃度的2.67倍和1.8倍，表明離心作用有效地使TGF-β1等生長因子濃縮在凝膠層。王天祥等[7]通過使用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定靜脈血、CGF中VEGF、TGF-β1等的濃度，且CGF與靜脈血相比之下，CGF中VEGF的含量增加了（21.90±2.44）倍，TGF-β1的含量增加了（7.59±2.03）倍，此實驗結果說明濃縮生長因子具有純化且提高血液中VEGF、TGF-β1等生長因子濃度的作用，使CGF中含有高濃度生長因子，進一步發揮其抗感染、促進骨組織形成、加速組織愈合等作用。

4 對犬貓疾病防治作用分析

4.1 角膜損傷

角膜損傷性疾病是當今世界上主要致盲性眼病之一，目前臨床上導致角膜致盲較為常見的原因主要有上皮損傷和角膜內皮損傷[11]。一般疾病發生，主要治療方式還是手術治療：主要包括全層角膜移植手術，也稱其為穿透性角膜移植術（enetrating keratoplasty，PIo）、板層角膜移植術（Lamellar keratoplasty，LPK）和角膜內皮移植術（Endothelial keratoplasty，EK）[12]。角膜移植術與其它器官移植相比，角膜移植是有著相當大的成功率。但是每年角膜供體短缺問題一直未得到有效的改善，且角膜移植存在很高排斥反應。CGF中與角膜瘢痕關系最密切的是TGF-β。TGF-β1、2、3的mRNA可在正常犬貓角膜上皮細胞和內皮細胞中檢測到，TGF-β1、2的mRNA可在角膜基質細胞中檢測到[13]。當角膜受到創傷后，其TGF-β1、2、3及其受體的表達增多[14]；并且角膜霧狀混濁的輕重與角膜TGF-β1mRNA的強弱也密切相關[15]；TGF-β可抑制眼睛表面瘢痕的形成，將其應用到臨床角膜疾病可取得一定療效。

4.2 口腔潰瘍

該疾病除哺乳犬貓外，各年齡、性別以及品種的犬貓都有可能發生，以夏季為多[16]。患病動物主要表現為無食欲，流涎，精神沉郁，不讓接觸，幾乎不能飲食。全身治療多是對因治療，采用補充維生素，減少發作次數[17]。局部治療以促進潰瘍創面愈合，緩解患病動物疼痛為目的。CGF中TGF-β、VEGF、PDGF、IGF和BMPs等。這些生長因子可以提高表皮細胞的移動能力，減少瘢痕的形成，促使肉芽組織快速生長，并且能輔助中性粒細胞加強機體防御，進而促進傷口愈合[17]。CGF在慢性潰瘍的治療中有積極作用[18]。

4.3 創傷愈合

創傷愈合是表皮細胞增生覆蓋創面的再上皮化和進入傷口的成纖維細胞增殖、分化和合成分泌細胞外基質的纖維化以及新生血管長入傷口的血管化等綜合作用的結果[19]。CGF中PDGF對中性粒細胞、單核細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞等有趨化吸引作用并使成纖維細胞受到強力刺激以致增殖及誘導其合成膠原和纖維連接蛋白等成份，以形成肉芽組織促進傷口愈合[18]；TGF-β也可以促進膠原積聚和傷口中肉芽組織形成；此外，增強膠原基因的表達可通過TGF-β與基因調節蛋白結合從而促進膠原的積聚[20]。應用外源性TGF-β可加強傷口的物理學成份提高傷口的張力和愈合率；FGF促進癱痕形成的作用；EGF和IGF都是提高慢性皮膚傷口的愈合率和傷口愈合后的張力；VEGF刺激內皮細胞生長促進傷口的血管化進程[20]。CGF可以提供傷口早期愈合所需的多種生長因子，可以減少瘢痕形成，提高愈合質量，值得在臨床上應用[21]。

4.4 皮膚病

皮膚病是發生在皮膚和附屬皮膚臟器的總稱。隨著犬、貓伴侶動物數量的增多，皮膚病的感染也日趨增多。當發生皮膚病時，針對不同的寄生蟲、真菌和細菌以及其他病菌皮膚病，一般首選抗生素類、抗真菌類和抗細菌類藥物，都具有很好的療效。有文獻研究CGF中TGF-β、VEGF和IGF對皮膚病有影響。銀屑病中IGF能調控鈣誘導的KCs分化相關的基因表達，參與表皮分層的異常，還參與了免疫機制的異常反應[22]；銀屑病患者皮損中VEGF含量較正常人顯著提高，其可能是銀屑病血管異常生成的重要促進因子[23]；銀屑病患者表皮的過度增殖可能是由于皮損處KC逃脫了TGF-β家族的配體和受體系統的抑制作用[24]。TGF-β在硬皮病皮膚硬化和光老化發揮著重要作用。TGF-β、VEGF、IGF對皮膚腫瘤也起著重要作用。可以進一步深入研究臨床上CGF對犬貓皮膚病的影響，是否可以提高療效。

4.5 慢性骨關節炎

骨關節炎是一種退行性的臨床綜合征，是由多種原因造成關節軟骨破壞引起的并伴有疼痛及殘疾等癥狀的疾病[25]。發病率隨著年齡的增加而增加。一般治療方法有減肥（針對肥胖犬貓）、水療法、理療以及外科手術治療。其CGF中PDGF能顯著促進骨髓基質干細胞的有絲分裂進而增加成骨細胞的數量，促進移植區的毛細血管生長[26]。TGF-β可促進成骨前體細胞的有絲分裂，進而促進骨細胞的生長發育[27]。IGF也可促進成骨細胞的有絲分裂，此外還可促進皮膚骨骼及神經系統細胞的生長發育[28]。VEGF可以促進新生毛細血管形成，促進成骨細胞的分化，提高堿性磷酸酶的表達，增強血管的通透性從而促進骨折愈合[29]。

4.6 神經損傷

近年研究發現，在CGF所含有的生長因子中，IGF不僅對大腦發育有一定影響，而且可抑制細胞凋亡，對許多中樞疾病發揮著保護作用且有助于神經細胞受損后的功能恢復[30]。VEGF對神經也具有保護作用[31]。EGF與組織修復、腫瘤發生以及胚胎發育有密切關系，并且能強烈刺激細胞分裂。EGF通過與表皮生長因子受體（EGFR）高親和力結合發揮作用，對多種中樞神經系統（CNS）受損如神經膠質瘤、視神經擠壓傷和脊髓損傷等均有一定的治療作用[32]。它可以營養髓鞘，減緩髓鞘脫失，對犬瘟熱腦炎疾病有一定治療作用[33]；促進神經干細胞（NSCs）分化為神經元，改善神經元丟失，促進CNS損傷后的功能修復。目前已經在動物模型和細胞培養中得到證實，但將這些方法應用于臨床治療仍需要進行更深入的研究。TGF-β1在中樞神經系統腫瘤、神經生長、保護、外傷及炎癥等方面也發揮一定的作用[34]。這些研究為中樞系統疾病的治療提供了新的研究方向，但目前尚未明確相關作用機制，有待進一步研究。

5 結束語

目前，國內外學者己開始將CGF纖維蛋白凝膠應用于醫療領域，如人牙周組織手術、種植外科手術、軟組織整形手術以及犬貓骨折手術，骨關節炎恢復，軟組織損傷愈合，角膜損傷修復中，并取得了很好的效果。由于CGF具有完全來源于自體血液，無毒性，無免疫原性，且制備簡便，費用低廉，不會發生交叉感染等優點，其臨床應用前景十分廣闊。但是，在國內寵物（犬、貓、馬）臨床，CGF應用的鮮見報道，鑒于其作用及特點，我們有理由期待CGF療法能夠發揮其應有的作用，造福動物。

然而，CGF濃度是決定其作用發揮的關鍵因素。如何保障所制取的CGF制劑中相關生長因子的含量，除制備技術之外，自體生長因子水平的高低起決定性作用。中國傳統獸醫的針灸療法具有調節機體固有機能的作用，我們的前期研究表明，電針療法對多種神經再生相關生長因子的產生具有促進作用[35]，通過針灸干預，有望提高相關生長因子的水平，從而有助于獲取更高質量的CGF，保障其作用的發揮[36]。