口蹄疫液相阻斷ELISA實(shí)驗(yàn)中常遇問題及詳細(xì)操作步驟

王秀東，鄒德穎，郭興，那永東，翟偉，曹凱捷

（盤錦檢驗(yàn)檢測(cè)中心，遼寧 盤錦 124010）

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA) 是一種用酶標(biāo)記已知的抗原或抗體，并使之吸附在固相載體表面發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，用于檢測(cè)大分子抗原和特異性抗體的技術(shù)[1]。在口蹄疫病毒抗體檢測(cè)中，液相阻斷ELISA實(shí)驗(yàn)是農(nóng)業(yè)部規(guī)定的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，判定結(jié)果較為客觀，而且能夠有效評(píng)價(jià)接種了FMD疫苗的動(dòng)物的抗強(qiáng)毒攻擊能力。由于酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)步驟較為復(fù)雜，且環(huán)環(huán)相扣，一旦某個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，將影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此必須明晰其實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)。

1 口蹄疫液相阻斷ELISA實(shí)驗(yàn)中常遇問題

相對(duì)來說，口蹄疫液相阻斷ELISA實(shí)驗(yàn)的過程是比較漫長(zhǎng)的，實(shí)驗(yàn)者常遇到以下幾個(gè)問題：①說明書過于精要，實(shí)驗(yàn)步驟不明晰，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)流程混亂，操作不嚴(yán)謹(jǐn)，還有可能會(huì)出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)過程中用錯(cuò)試劑的情況；②在抗原抗體反應(yīng)中，需要用到96孔U型板進(jìn)行血清稀釋，有時(shí)候?qū)嶒?yàn)者會(huì)將ELISA反應(yīng)板與之混淆；③在抗原抗體反應(yīng)稀釋血清的環(huán)節(jié)，實(shí)驗(yàn)步驟較復(fù)雜，而且要兩次調(diào)整移液器量程，如果沒有按照實(shí)驗(yàn)步驟調(diào)整刻度值，將導(dǎo)致所加PBST液量錯(cuò)誤，繼而導(dǎo)致稀釋倍數(shù)計(jì)算錯(cuò)誤；④酶聯(lián)免疫吸附板條未牢牢固定在板架上，在洗板甩干/脫干的環(huán)節(jié)容易脫落，如果之前未加標(biāo)記，很容易分不清樣品序號(hào)順序 。

針對(duì)上述情況，可采取以下措施有效避免：①仔細(xì)閱讀說明書，揣摩其中含義。逐字逐句閱讀說明書，對(duì)于有疑問或不理解的詞語，應(yīng)自己查閱資料了解，如果不明確實(shí)驗(yàn)步驟，可以詢問實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)豐富的人，直到基本掌握實(shí)驗(yàn)操作步驟；②做好實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作。在實(shí)驗(yàn)中，所用實(shí)驗(yàn)器材有5～50μL的單道移液器及多道移液器、50～300μL的多道移液器、、加樣槽、廢棄液瓶，以及20mL、50mL、250mL、500mL量筒，以及300mL、500mL燒杯，準(zhǔn)備好足夠數(shù)量的實(shí)驗(yàn)器材，檢查試劑是否齊全，根據(jù)實(shí)驗(yàn)人員數(shù)量準(zhǔn)備足夠的96孔U型反應(yīng)板。

2 口蹄疫液相阻斷ELISA實(shí)驗(yàn)詳細(xì)操作步驟

2.1 配備PBST液

一般情況下，一板實(shí)驗(yàn)需要用到500mL1倍PBST液，因此可根據(jù)實(shí)驗(yàn)板書計(jì)算藥液用量，再使用25倍PBST濃縮液配置1倍PBST液。檢查25倍PBST濃縮液平底有無結(jié)晶，如無可直接稀釋，若有則置入水浴鍋中直至結(jié)晶融化再稀釋，20mL量筒量取20mL濃縮液，倒入500mL量筒中，加蒸餾水至500mL刻度線，混勻，倒入加樣槽內(nèi)。

2.2 抗原抗體反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)過程的具體步驟如下：①稀釋血清。以每板檢測(cè)10份血清為例，取潔凈的96孔U型反應(yīng)板，采用50～300μL的多道移液器，刻度調(diào)至75μL，吸取1倍PBST液加入A1～A10孔中；刻度調(diào)整至50μL，往A～H行的1～11列孔、A12、B12中加入1倍PBST液。使用5～50μL的單道移液器，吸取25mL檢測(cè)血清，加入A1～A10孔中；將多道移液器的刻度調(diào)整至50μL，插入A1～A10孔中反復(fù)吸取數(shù)次，混勻，再吸取50μL藥液，加入到對(duì)應(yīng)的B列孔中，重復(fù)上述操作，將同一列的液體50mL吸取到下一行的孔中，直至H列，最后吸取50μL藥液棄去，使得從A列到H行，血清稀釋倍數(shù)依次為1∶4、1∶8……1∶512。在A11孔加入陽性血清50μL，采用相同的方式進(jìn)行稀釋，使其稀釋倍數(shù)為1∶16、1∶32……1∶2048，在A12孔中加入陰性血清50μL，稀釋至B12，稀釋濃度分別為1∶2、1∶4；②添加病毒抗原。通常一板實(shí)驗(yàn)需要5mL抗原，根據(jù)實(shí)驗(yàn)板數(shù)計(jì)算工作濃度抗原數(shù)量，根據(jù)實(shí)際濃度，稀釋抗原，并多配置2～3mL備用，按照說明書的要求加入反應(yīng)板孔中，封板，輕微振蕩，37℃恒溫箱中放置90min。

2.3 余下實(shí)驗(yàn)步驟

在抗原抗體實(shí)驗(yàn)后，所需進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)步驟有：①轉(zhuǎn)移抗體抗原混合液，根據(jù)說明將抗原抗體混合液轉(zhuǎn)移至口蹄疫O型、A型或者亞洲I型相應(yīng)的ELISA反應(yīng)板中，每孔50μL，封板，37℃恒溫箱中溫育60min；②洗板。棄掉ELISA板中液體，移液器吸取1倍PBST液260至280μL置入孔中，再甩出，重復(fù)3～5次，吸水紙拍干；③添加口蹄疫O型或A型豚鼠抗體。往ELISA板各孔中加入ELISA板中50μL口蹄疫O型、A型或者亞洲I型豚鼠抗體，封板，37℃溫育30min；④洗板；⑤加兔抗豚鼠酶結(jié)合物；⑥加底物；⑦加終止液，記錄酶標(biāo)儀刻度值。

3 結(jié)語

口蹄疫液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)步驟繁多，如果做實(shí)驗(yàn)的人不嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，很有可能得到不成立的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，前功盡棄，影響到病毒抗體檢測(cè)工作效率及質(zhì)量[2]。對(duì)于實(shí)驗(yàn)者，尤其是初學(xué)者，在做實(shí)驗(yàn)之前，最好能夠詳細(xì)閱讀說明書，不放過其中的任何一個(gè)字眼，仔細(xì)揣摩其中的意思，直到能夠記住實(shí)驗(yàn)步驟及其中的一些注意事項(xiàng)。

[1]李世鳳,吳得瑞.淺析影響口蹄疫O型液相阻斷ELISA實(shí)驗(yàn)的因素[J].中獸醫(yī)學(xué)雜志,2017,(01):72.

[2]王娟娟.口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測(cè)兩種實(shí)驗(yàn)方法結(jié)果對(duì)比[J].吉林畜牧獸醫(yī),2017,38(08):5-6.