鮮牛奶中黃曲霉毒素M1檢測的幾種方法及控制措施

徐 琳

(黑龍江省杜爾伯特蒙古族自治縣動物衛生監督所,黑龍江 大慶 166200)

1 理化性質

黃曲霉毒素M1(AFM1)是黃曲霉毒素B1(AFB1)的羥基化衍生物，二呋喃環的氧雜萘鄰酮作為其基本結構，分子式為C17H12O7，相對分子量為328Da，熔點可高達299℃。AFM1是一種無色的長方形片狀結晶，在365 nm紫外光照射下會呈現藍紫色熒光，其在極性有機溶劑中容易溶解，但在非極性溶劑(如乙醚、石油醚和正己烷等)中無法溶解。該毒素具有極強的耐熱性，只有在溫度達到299℃是才會被破壞，因此牛奶中所含的AFM1經過常規烹調溫度、超高溫滅菌或者巴氏消毒后基本上不會被破壞。AFM1在部分化學試劑(如丙酮和次氯酸鈉)作用下可完全被分解，因此常用于對污染過AFM1的材料或者容器進行解毒。

2 檢測方法

免疫親和柱法。原理是對檢測樣品先進行離心、脫脂、過濾處理，接著使用免疫親和柱對濾液進行層析凈化，將所含雜質除去后再來洗脫AFM1，之后通過熒光光度法對AFM1進行定量。樣品預處理，即取50 mL液體牛奶和牛乳制品放入離心管中，添加氯化鈉1 g，溶解后以4000 r/min的速度進行10 min離心，上層為脂肪層，移取下層液體，經過玻璃纖維濾紙過濾后備用。柱凈化，即先連接玻璃注射器和免疫親和柱，準確吸取10 mL之前處理好的澄清濾液加入，接著連接空氣壓力泵，通過壓力調節控制溶液以3～6 mL/min的速度流過免疫親和柱，直到柱體有2～3 mL空氣通過，之后加入10 mL 10%甲醇溶液對柱子進行2次清洗，流出液體全部棄去，再準確加入1 mL 80%甲醇溶液將已經免疫結合在柱上的AFM1洗脫，注意此時調整流速變為1～2 mL/min，將洗脫液收集在干凈的玻璃試管中待檢。熒光光度檢測，先分別在激發波長360 nm和發射波長450 nm下對熒光光度計進行校準，綠色標定管為0，紅色標定管為2.0，黃色標定管為1.0±0.2；接著在50 mLAFM1顯陰性的樣品中分別添加濃度為0、0.1 μg/L、0.5 μg/L、1 μg/L的AFM1系列標準溶液，按照以上分析步驟進行分離純化，在濾過的洗脫液再分別添加1 mL 0.002%溴溶液和AFM1產生衍生物，放入熒光光度計中對熒光強度進行測定，由此繪制熒光強度和AFM1標準濃度的標準曲線；最后在待檢樣品洗脫液添加溴溶液衍生，對其熒光強度進行測定，根據標準曲線計算其中所含的AFM1。該檢測方法的優點是凈化效果好、靈敏度高、特異性高等，同時樣品的前處理過程明顯簡化，不需要使用AFM1標準物質，使操作者在實驗過程中可能受到的潛在危害大幅度降低。但整個操作比較復雜、繁瑣，且容易出現浪費試劑和環境污染的情況，導致在一定程度上限制該方法的應用推廣。

酶聯免疫吸附法(ELISA)。原理是固定于酶標板上的抗原和待檢樣品中所含的AFM1會特異性競爭抗體，并在固相載體表面構成抗原抗體復合物，將多余抗體成分洗去后添加酶標Ⅱ抗，與抗體反應，在酶的作用下促使顯色劑顯色，根據顯色深淺程度對樣品中所含的AFM1量進行判斷。樣品處理，即取50 mL待檢牛奶樣品，先進行降溫處理，直到溫度低于10℃，接著以3500 r/min的速度進行10 min離心，之后用吸管吸去上層脂肪層，取下層牛奶液進行檢測。檢測時，先將抗AFM1抗體包被于微孔板上，置于4℃條件下進行過夜處理，使其充分封閉；先在每孔中添加AFM1標準溶液或者樣品處理液，接著添加AFM1酶結合物，置于37℃下經過30 min反應；洗板后在每孔中分別添加酶基質和顯色劑，置于37℃下進行15 min顯色，通過目視法或者儀器法進行測定；根據結果繪制標準曲線，并據此計算樣品中所含的AFM1量。該檢測方法的優點是特異性強、靈敏、快速、成本低等，儀器操作簡單，使工作人員的勞動量明顯減少，且待檢樣品無需經過特殊處理，可直接進行測定，在有大批樣品進行檢測篩選使用，且在現場檢測時也可選用。

3 控制措施

嚴格管理奶牛飼料。奶牛禁止飼喂發生霉變的飼料，因此在飼料生產、加工、運輸、保存過程中要加強管理，避免收獲飼料原料時經受雨淋，且經過適當曬干。合理控制青貯飼料質量，防止腐敗，青貯飼料制作完成后要立即使用塑料薄膜覆蓋，盡可能使其密封。調控精飼料(如玉米、豆粕等)的含水量和溫度。確保飼料貯存條件良好，要求倉庫干燥、陰涼，且適當通風，還要注意飼料四周要留有適當的儲存空間。料倉要定期進行清潔，避免鼠咬和發生蟲害等，尤其是倉中全部腐敗變質的飼料必須清理干凈。

加強檢驗檢測。要求乳制品生產企業采取質量安全責任，并根據相關法律法規進行生鮮牛奶收購，且必須對其黃曲霉毒素M1等各項指標進行檢測。如果生鮮乳檢測不合格，要依法采取無害化處理。