初治肺結核患者耐藥情況、耐藥危險因素、耐藥基因及其輔助診斷技術研究

楊芳 ，張磊

結核病是威脅人類健康的重大傳染病之一，近年來由于結核分枝桿菌耐藥增多而導致結核病出現復燃之勢［1］。據世界衛生組織（WHO）統計，目前全球約有5 000萬人受到耐藥結核分枝桿菌感染［2］，我國結核分枝桿菌耐藥率約為37.8%，且初治結核病患者結核分枝桿菌耐藥率雖低于復治結核病患者，但耐藥率仍在35%左右［3］，因此初治結核病患者結核分枝桿菌耐藥已成為重要的公共衛生問題之一。近年研究發現，在初治肺結核患者中不僅檢測到對一線抗結核藥物如利福平、異煙肼等耐藥的菌株，還檢測到對二線抗結核藥物耐藥的菌株［4］，提示耐藥結核分枝桿菌于人際間傳播速度加快，給結核病的防控工作帶來了新的挑戰。本研究旨在探討初治肺結核患者耐藥情況、耐藥危險因素、耐藥基因及其輔助診斷技術，為結核病的有效防控及減少結核分枝桿菌耐藥提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年7—12月西安市胸科醫院收治的初治肺結核患者478例，均未進行過抗結核治療或治療時間＜1個月，痰培養結核分枝桿菌陽性并完成藥敏試驗；排除標準：伴有嚴重心血管疾病、免疫系統疾病及糖尿病者。所有患者中男316例，女162例；年齡6～91歲，中位年齡36歲（Q131歲，Q462歲）；常住人口450例，流動人口28例；城鎮居民211例，農村居民267例。

1.2 痰培養及藥敏試驗 采用美國BD公司BACTEC MGIT 960系統進行痰培養及藥敏試驗，其中藥敏試驗采用美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）推薦的比例法（method of proportion，MOP），檢測藥物包括4種一線抗結核藥物（包括異煙肼、利福平、乙胺丁醇及鏈霉素）和7種二線抗結核藥物（包括左氧氟沙星、利福噴丁、莫西沙星、對氨基水楊酸鈉、卷曲霉素、丙硫異煙胺、阿米卡星），判斷臨界值為1%。

1.3 耐藥類型判斷標準 結核分枝桿菌對1種一線抗結核藥物耐藥定義為單耐藥結核病（MR-TB），對1種以上一線抗結核藥物耐藥但不包括同時對異煙肼和利福平耐藥定義為多耐藥結核病（PR-TB），至少同時對異煙肼和利福平耐藥定義為耐多藥結核病（MDR-TB），對異煙肼和利福平耐藥同時對氟喹諾酮類藥物及二線抗結核藥物（卷曲霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素）中的至少1種耐藥定義為廣泛耐藥結核病（XDR-TB）。本研究將出現MR-TB、PR-TB、MDR-TB、XDR-TB中的任1種者統稱為耐藥肺結核。

1.4 耐藥相關因素 于患者就診時采用標準問卷收集其人口學特征，包括性別、年齡、人口類型、受教育程度、家庭人均月收入、身高、體質量并計算體質指數（BMI），以BMI＜18.5 kg/m2為 偏 瘦，18.5～23.9 kg/m2為 正 常，24.0～27.9 kg/m2為超重/肥胖；分析患者臨床特征，包括咳嗽時間、咯血或血痰、雙肺受累肺野數及肺結核患者接觸史；所有患者進行胸部X射檢查并由專業醫師判斷雙肺受累情況，以第2、4肋骨前端下緣水平線為界，將雙肺分為上、中、下3野，記錄雙肺受累肺野數。

1.5 耐藥基因檢測及輔助診斷技術 （1）采用基因芯片法檢測利福平耐藥相關rpoB基因、異煙肼耐藥相關katG/inhA基因突變情況，所用儀器為晶芯 RTisochipTM-A恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀（博奧生物集團有限公司生產）。（2）采用熒光探針法進行雙通道聚合酶鏈反應（PCR），擴增結核分枝桿菌DNA片段并采用恒溫擴增法檢測結核分枝桿菌RNA，TB-SAT試劑盒購自上海仁度生物科技有限公司，所用儀器為ThermoFisher生產的Veriti儀，以擴增CT值≥40為陽性。（3）采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）進行結核感染T細胞檢測，結核分枝桿菌免疫反應檢測值〔TB（T-N）〕≥14為陽性，TB-IGRA試劑盒購自北京萬泰生物藥業股份有限公司。（4）采用蛋白芯片法檢測結核抗體三項，包括LAM抗體、38DKa抗體及16DKa抗體，TB03A試劑盒購自南京大淵生物技術工程有限責任公司。

1.6 統計學方法 采用EpiData 3.1軟件建立數據庫并雙人雙機錄入數據，采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析。計量資料以（x ±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料以百分數表示，采用χ2檢驗或Fisher's確切概率法；采用Kappa值判斷耐藥基因檢測與藥敏試驗的一致性，Kappa值≤0.20為一致性極低，0.21～0.40為一致性一般，0.41～0.60為一致性中等，0.61～0.80為一致性較高，0.81～1.00為幾乎完全一致；初治肺結核患者耐藥的危險因素分析采用多因素Logistic回歸分析（逐步法）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 耐藥情況 478例患者中126例耐藥，耐藥率為26.4%。478例患者中對一線抗結核藥物異煙肼耐藥64例（13.4%），利福平耐藥33例（6.9%），乙胺丁醇耐藥20例（4.2%），鏈霉素耐藥75例（15.7%）；對二線抗結核藥物左氧氟沙星耐藥28例（5.9%），利福噴丁耐藥28例（5.9%），莫西沙星耐藥23例（4.8%），對氨基水楊酸鈉耐藥21例（4.4%），卷曲霉素耐藥7例（1.5%），丙硫異煙胺耐藥2例（0.4%），阿 米 卡 星 耐 藥2例（0.4%）；MR-TB 50例（10.5%），MDR-TB 30例（6.3%），XDR-TB 21例（4.4%），其他25例（5.2%）。

2.2 耐藥危險因素 不同耐藥情況患者男性比例、人口類型、家庭人均月收入、BMI、咯血或血痰發生情況、肺結核患者接觸史比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；不同耐藥情況患者年齡、受教育程度、咳嗽時間≥3周者所占比例、雙肺受累肺野數比較，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。將年齡（賦值：＜30歲=0，30～59歲=1，≥60歲=2）、受教育程度（賦值：初中及以下=0，高中/中專=1，大學及以上=2）、咳嗽時間≥3周（賦值：否=0，是=1）、雙肺受累肺野數（賦值：1～5個=0，6個=1）作為自變量，將藥敏試驗結果（賦值：敏感=0，耐藥=1）作為因變量進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示年齡、雙肺受累肺野數是初治肺結核患者耐藥的危險因素（P＜0.05，見表2）。

表2 初治肺結核患者耐藥相關因素的多因素Logistic回歸分析結果Table 2 Multivariate Logistic regression analysis on related factors of drug resistance in untreated patients with pulmonary tuberculosis

2.3 耐藥基因檢測結果 478例患者中210例行利福平耐藥相關rpoB基因、異煙肼耐藥相關katG/inhA基因檢測，結果顯示利福平耐藥相關rpoB基因突變診斷初治肺結核患者耐藥的靈敏度為83.3%，特異度為99.0%，陽性預測值為83.3%，陰性預測值為99.0%，Kappa值為0.823；異煙肼耐藥相關katG/inhA基因突變診斷初治肺結核患者耐藥的靈敏度為58.6%，特異度為100.0%，陽性預測值為100.0%，陰性預測值為93.8%，Kappa值為0.709（見表3）。

表1 初治肺結核患者耐藥相關因素的單因素分析〔n（%）〕Table 1 Univariate analysis on related factors of drug resistance in untreated patients with pulmonary tuberculosis

表3 利福平耐藥相關rpoB基因、異煙肼耐藥相關katG/inhA基因突變對初治肺結核患者耐藥的診斷價值（例）Table 3 Diagnostic value of rifampin-resistant related rpoB and isoniazidresistant related katG/inhA gene mutation on drug resistance in untreated patients with pulmonary tuberculosis

2.4 輔助診斷技術檢測結果

2.4.1 雙通道PCR 37例患者雙通道PCR結核分枝桿菌RNA擴增結果缺失，雙通道PCR結核分枝桿菌RNA擴增診斷初治肺結核患者耐藥的靈敏度為75.2%，特異度為34.9%，陽性預測值為27.5%，陰性預測值為81.1%，Kappa值為0.449；10例患者雙通道PCR結核分歧桿菌DNA擴增結果缺失，雙通道PCR結核分歧桿菌DNA擴增診斷初治肺結核患者耐藥的靈敏度為82.4%，特異度為29.4%，陽性預測值為29.9%，陰性預測值為82.1%，Kappa值為0.436（見表4）。

2.4.2 結核感染T細胞檢測 71例患者結核感染T細胞檢測結果缺失；結核感染T細胞檢測診斷初治肺結核患者耐藥的靈敏度為71.4%，特異度為22.7%，陽性預測值為26.0%，陰性預測值為67.7%，Kappa值為0.361（見表5）。

2.4.3 結核抗體三項 35例患者結核抗體三項結果缺失。LAM抗體診斷初治肺結核患者耐藥的靈敏度為65.3%，特異度為39.7%，陽性預測值為28.2%，陰性預測值為75.9%，Kappa值為0.465；38DKa抗體診斷初治肺結核患者耐藥的靈敏度為69.5%，特異度為43.7%，陽性預測值為30.9%，陰性預測值為79.8%，Kappa值為0.506；16DKa抗體診斷初治肺結核患者耐藥的靈敏度為2.5%，特異度為92.2%，陽性預測值為12.0%，陰性預測值為72.5%，Kappa值為0.691（見表6）。

表4 雙通道PCR結核分枝桿菌RNA、DNA擴增對初治肺結核患者耐藥的診斷價值（例）Table 4 Diagnostic value of Mycobacterium tuberculosis RNA and DNA amplification on drug resistance in dual-channel PCR in untreated patients with pulmonary tuberculosis

表5 結核感染T細胞檢測對初治肺結核患者耐藥的診斷價值（例）Table 5 Diagnostic value of T cell test for tuberculosis infection on drug resistance in untreated patients with pulmonary tuberculosis

3 討論

遏制耐藥結核病的流行是當前形勢下控制結核病傳播的關鍵，但耐藥結核病對常用抗結核藥物耐藥、治療困難、傳染風險大，可導致患者經濟負擔加重，已成為我國公共衛生問題之一［2］。由于初治肺結核患者未服用過抗結核藥物或治療時間＜1個月，因此其體內結核分枝桿菌耐藥并非藥物作用導致，而是直接感染了耐藥結核分枝桿菌［5］。了解初治肺結核患者耐藥情況、耐藥類型對了解肺結核傳播、流行規律并制定有針對性的防控措施具有重要意義。

表6 結核抗體三項對初治肺結核患者耐藥的診斷價值（例）Table 6 Diagnostic value of triune tuberculosis antibodies on drug resistance in untreated patients with pulmonary tuberculosis

本研究結果顯示，478例初治肺結核患者耐藥率為26.4%，對一線抗結核藥物異煙肼耐藥率為13.4%，利福平耐藥率為6.9%，與既往文獻報道相似［4，6-7］。MDR-TB具有治療成功率低、治療費用昂貴、致死率高、治療藥物毒副作用大等特點，是耐藥結核病研究熱點之一［8-9］。本研究結果顯示，478例初治肺結核患者中檢出MDR-TB 30例（6.3%），高于黃靜靜等［4］研究結果，提示該地區應注意MDR-TB的流行。

研究表明，年齡較大、存在基礎疾病、免疫力低下者感染耐藥結核分枝桿菌的風險較大［10］。本研究進行的單因素分析結果顯示，不同耐藥情況患者年齡、受教育程度、咳嗽時間≥3周者所占比例、雙肺受累肺野數間存在差異，進一步行多因素Logistic回歸分析發現，年齡、雙肺受累肺野數是初治肺結核患者耐藥的危險因素，與FURIN等［11］研究結果一致；本研究未發現不同藥敏試驗結果患者男性比例、人口類型、家庭人均月收入、BMI、咯血或血痰發生情況、肺結核患者接觸史間存在差異，可能與樣本量較小有關，但需要指出的是，126例耐藥肺結核患者中年齡＜30歲者所占比例為36.5%，而237例年齡＜30歲的初治肺結核患者耐藥肺結核發生率為19.4%，提示初治肺結核患者應積極行藥敏試驗及耐藥篩查并盡量覆蓋一線和二線抗結核藥物，而不應依據年齡、生活習慣等忽視耐藥肺結核的篩查。

近年來，隨著基因測序技術發展，結核分枝桿菌耐藥基因檢測得以快速推廣應用。本研究結果顯示，利福平耐藥相關rpoB基因診斷初治肺結核患者耐藥的靈敏度為83.3%，特異度為99.0%，陽性預測值為83.3%，陰性預測值為99.0%，Kappa值為0.823，提示rpoB基因突變對利福平耐藥的診斷價值較高，基因檢測技術有望成為早期發現耐藥結核分枝桿菌的有力手段［12］；異煙肼耐藥相關katG/inhA基因突變診斷初治肺結核患者耐藥的靈敏度為58.6%，特異度為100.0%，陽性預測值為100.0%，陰性預測值為93.8%，Kappa值為0.709，低于耿紅等［13］研究結果，提示katG/inhA基因突變對異煙肼耐藥的診斷價值一般，或耐異煙肼結核分枝桿菌可能與katG/inhA基因之外的其他基因突變有關，仍需進一步研究證實。

由于結核分枝桿菌痰培養所需時間較長，因此雙通道PCR、結核感染T細胞檢測、結核抗體三項等結核分枝桿菌檢測技術亦常應用［14-15］。本研究結果顯示，雙通道PCR結核分枝桿菌RNA擴增診斷初治肺結核患者耐藥的靈敏度為75.2%，特異度為34.9%，陽性預測值為27.5%，陰性預測值為81.1%，Kappa值為0.449；雙通道PCR結核分歧桿菌DNA擴增診斷初治肺結核患者耐藥的靈敏度為82.4%，特異度為29.4%，陽性預測值為29.9%，陰性預測值為82.1%，Kappa值為0.436；結核感染T細胞檢測診斷初治肺結核患者耐藥的靈敏度為71.4%，特異度為22.7%，陽性預測值為26.0%，陰性預測值為67.7%，Kappa值為0.361；LAM抗體診斷初治肺結核患者耐藥的靈敏度為65.3%，特異度為39.7%，陽性預測值為28.2%，陰性預測值為75.9%，Kappa值為0.465；38DKa抗體診斷初治肺結核患者耐藥的靈敏度為69.5%，特異度為43.7%，陽性預測值為30.9%，陰性預測值為79.8%，Kappa值為0.506；16DKa抗體診斷初治肺結核患者耐藥的靈敏度為2.5%，特異度為92.2%，陽性預測值為12.0%，陰性預測值為72.5%，Kappa值為0.691，提示雙通道PCR、結核感染T細胞檢測、結核抗體三項對初治肺結核患者耐藥的診斷價值一般，因此應注意結合地區耐藥結核病流行規律及結核分枝桿菌輔助診斷技術的靈敏度、特異度等，以提高耐藥結核分枝桿菌檢出率。

綜上所述，初治肺結核患者耐藥率為26.4%，MDR-TB檢出率為6.3%，應注意MDR-TB的流行；年齡、雙肺受累肺野數是初治肺結核患者耐藥的危險因素，應加以重視并注意耐藥篩查；rpoB基因突變對利福平耐藥的診斷價值較高，但katG/inhA基因突變對異煙肼耐藥的診斷價值一般，雙通道PCR、結核感染T細胞檢測、結核抗體三項對初治肺結核患者耐藥的診斷價值亦一般，需結合地區耐藥結核病流行規律選擇應用；但本研究為單中心研究且樣本量有限、部分患者信息不完整，存在一定選擇偏倚，結論仍需擴大樣本量、采用規范化的樣本處理方案等進一步證實。

作者貢獻：楊芳負責數據處理、分析、撰寫論文；張磊負責研究設計與實施、質量監督、審校。

本文無利益沖突。