利用CRISPR/Cas9技術高效建立FUS—GFP熒光報告細胞系

陳麗

【摘 要】 利用CRISPR/Cas9基因敲入技術建立穩定表達FUS（fused in sarcoma）的細胞系。方法：擴增FUS 5'arm序列，puro-T2A-GFP報告基因，FUS 3'arm序列，將3個片段一次連接至目的載體上。制作長鏈ssDNA做為同源重組模板。將FUS agRNA，cas9，ssDNA共轉染hela和hct116細胞，通過細胞同源重組修復途徑，實現報告基因GFP的敲入，嘌呤霉素篩選陽性細胞，流式分選純化和富集帶有綠色熒光的細胞，建立表達FUS-GFP融合蛋白的細胞系。結果：成功構建了帶有FUS 5'arm + puro-T2A-GFP+ FUS 3'arm的靶向載體質粒。瓊脂糖凝膠顯示ssDNA的成功產生。共聚焦顯微鏡顯示轉染后藥篩48小時的hela和hct116細胞均出現綠色熒光。流式分選顯示，帶有綠色熒光的細胞比例約為30%-40%。結論：利用CRISPR/Cas9技術成功構建了FUS-GFP熒光報告細胞系。

【關鍵詞】 CRISPR/Cas9；knock in；同源重組；ssDNA；FUS

【中圖分類號】R365 【文獻標志碼】B 【文章編號】1005-0019（2018）24-001-01

規律成簇間隔短回文重復系統（CRISPR-Cas9）是一種具有核酸內切酶活性的復合體，識別特定的 DNA序列切割造成雙鏈DNA斷裂，當存在同源模板的條件下，發生同源重組修復[1]，造成基因敲入（knock in）。這通常通過在插入DNA的任一側構建具有0.5-1kb的兩個同源臂的靶向載體來實現。目前，單鏈寡脫氧核苷酸（ssDNA）已被用作供體模板與工程化核酸酶的組合，并且比雙鏈供體質粒更有效[2]。

FUS，全稱為fused in sarcoma，是一種RNA結合蛋白，FUS在細胞核中富集，但在額顳葉癡呆（FTD）或肌萎縮側索硬化（ALS）患者的死后腦和脊髓中，存在于神經元和神經膠質細胞的細胞質聚集體中[3]。已有報道，FUS發生相分離形成液態冷凝物，硬化成固態，這可能是神經退行性疾病中不容聚集體形成的原因。此外，FUS的入核轉運可以溶解液態相分離結構，防止固態凝聚體造成的神經細胞毒性[4]。另外，FUS在DNA損傷中的功能涉及與組蛋白脫乙酰酶1的直接相互作用[5]。本研究擬構建FUS-GFP熒光報告細胞系，通過活細胞工作站，在X射線照射造成細胞DNA雙鏈斷裂的條件下，通過熒光觀察FUS液滴融合或分離現象。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 方法

1.2.1 引物序列的設計

1.2.2 PCR法擴增目的基因序列 FUS 5'arm和FUS 3'arm以基因組為模板，puro-T2A-GFP以質粒為模板，用上述引物進行PCR擴增，使用PrimeSTAR高保真酶（Takara R010B），方法見說明書。PCR產物回收后，測濃度待用。

1.2.3 構建靶向載體 目的載體pcDNA3.1雙酶切后，經電泳割取目的條帶，回收測濃度。將線性化載體和上述3條PCR片段按比例混合，使用諾維贊多片段連接試劑盒（諾唯贊 C113-01），實現多個線性化DNA的重組。重組產物經轉化，挑克隆鑒定后提質粒送測序。正確的靶向載體命名為pcDNA3.1-FUS-GFP。

1.2.4 Guide-it Long ssDNA system產生ssDNA 用適當的磷酸化引物以靶向載體pcDNA3.1-FUS-GFP為模板PCR產生dsDNA。

使用Guide-it Long ssDNA system（Clontech 632644）產生ssDNA，方法見說明書。

1.2.5 FUS sgRNA的構建

將上述寡聚核苷酸單鏈變性、退火后形成雙鏈。雙鏈sgRNA寡聚核苷酸與線性化的pGL3-U6-sgRNA質粒相連獲得pGL3-U6-FUS sgRNA質粒。

1.2.6 轉染hela細胞系和hct116細胞系 轉染步驟見說明書（Invitrogen STEM00003）。轉染后24h加藥。之后每天換液加嘌呤霉素篩選陽性細胞。

1.2.7 陽性細胞的分選 加藥條件下將細胞擴大培養至10cm盤。消化細胞，PBS重懸，過細胞篩收集于流式管上機。

3 結果

3.1 產生ssDNA 靶向載體按方法1.1.4產生ssDNA。將雙鏈及單鏈DNA在瓊脂糖凝膠上進行電泳。結果如圖1。

3.2 熒光 轉染后藥篩48小時，可見hela和hct116細胞中均有綠色熒光，如圖2。說明sgRNA和cas9在FUS的起始密碼子附近造成DNA雙鏈斷裂，含有GFP以及兩端各750bp同源臂的ssDNA侵入到DNA斷裂處，通過細胞的同源重組修復途徑，實現報告基因GFP的敲入。

3.3 流式分選 流式分選純化和富集帶有綠色熒光的陽性細胞，如圖3。可見，hela細胞和hct116細胞中帶有綠色熒光的細胞比例大約分別為33%和40%。

4 討論

CRISPR/Cas9技術由于能快速，高效，簡便地靶向基因組任何基因，在2012年開始像爆炸一般流行起來。近年來，相分離又成為生物學研究的一個熱點，相分離與疾病的關系的研究主要集中在神經退行性疾病。FUS可以發生相分離，其在細胞質中聚集是患有額顳葉癡呆或肌萎縮側索硬化的患者中的病理性標記。并且，DNA修復的缺陷與神經退行性疾病有廣泛的聯系，但確切的機制知之甚少。本研究構建FUS-GFP熒光報告細胞系，可以通過活細胞工作站，在X射線照射造成細胞DNA雙鏈斷裂的條件下，通過熒光觀察FUS液滴融合或分離現象，從而方便研究FUS蛋白在DNA損傷修復等調節下的動態變化。

參考文獻

[1] Maria Jasin and Rodney Rothstein. “Repair of strand breaks by homologous recombination.” Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 5.11 （2013）： a012740.

[2] Peng， Y. et al. Making designer mutants in model organisms. Development 141，4042–4054 （2014）.

[3] Mackenzie， I.R.， Rademakers， R.， and Neumann， M. （2010）. TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Lancet Neurol.9， 995–1007.

[4] Guo，L.，et al.（2018）. Nuclear-import receptors reverse aberrant phase transtions of RNA-binding protein with prion-like domains.Cell，173（3），677-692.

[5] Wang WY.，et al.（2013）.Interaction of FUS and HDAC1 regulates DNA damage response and repair in neurons. Nature Neuroscience，16（10）：1383-91.