茶多酚的化學組成及其含量測定與結構鑒定

江　瀅　沈思婷　夏如楓　樊雪怡　韓　偉

（華東理工大學藥學院中藥現代化工程中心，上海200237）

0　引言

茶多酚（Tea Phlyphenols）又名茶單寧，是天然茶葉中分離提純的30多種酚類化合物的復合體，是茶葉中含生物活性成分的一類重要化合物。茶多酚具有極強的抗氧化性，能起到防治心血管疾病、提高免疫力、防衰老、抑菌、抗癌等多種藥理作用。茶多酚近年來被廣泛應用于食品、化妝品、保健品、醫藥等領域，被譽為21世紀對人類健康產生巨大影響的化合物。

茶多酚的主要化學成分為黃烷醇（兒茶素）類、花青素類、黃酮及黃酮醇類和酚酸類等。其中，兒茶素類化合物為主要成分，占茶多酚總量的65%～80%。本文對茶多酚中主要化學成分的含量測定和結構鑒定方法進行了歸納和總結。

1　茶多酚分析

許陳和張紅雨[1]對現有的茶多酚分析測試方法進行了介紹，其含量測定方法主要有：高錳酸鉀氧化法、分光光度法、原子吸收法、近紅外光譜分析法、氣相色譜法、高效液相色譜法、毛細管電泳法、膠束電動毛細管色譜法、微乳電動色譜法、高速逆流色譜法和質譜聯用法等。

1.1　茶多酚的含量測定

1.1.1分光光度法

對于茶多酚總量的測定，現在使用最廣泛的是分光光度法。我國國家標準采用的是酒石酸亞鐵比色法[2-3]，其原理是茶多酚和酒石酸亞鐵產生的藍紫色或紅紫色絡合物在540 nm處的吸光度與茶多酚的濃度成正比。然而，國際上大多使用沒食子酸作為標準品，用Folin-Denis試劑與茶多酚生成一定條件下遵從朗伯-比耳定律的絡合物來測定茶多酚的總量。

肖純[4]等探討了使用該試劑分光光度法測量茶多酚的適用條件，得出以下結論：Folin-Denis試劑雖然專一性較差，但它能和一元、二元、多元酚反應呈色，并且靈敏度高，分光光度法可以作為茶或茶湯中酚類物質的總量分析方法。

1.1.2高錳酸鉀氧化滴定法

因為酚羥基具有還原性，所以酚羥基能和高錳酸鉀發生氧化還原反應。通過滴定后計算高錳酸鉀的消耗量即可得到茶多酚的含量。該方法雖然操作簡單，但是不易控制滴定終點。同時，高錳酸鉀是強氧化劑，選擇性不高，得到的結果容易有誤差。

1.1.3紫外分光光度法

茶多酚可溶于有機溶劑乙醇，在其最大吸收波長處，可采用紫外分光光度法測定其含量。

張洪杰[5]等使用該方法快速測定了口香糖中茶多酚的含量，得到茶多酚的測定波長為274 nm，平均回收率為95.1%～102.2%，相對標準偏差小于0.29%。該方法簡易快速，測定茶多酚含量具有一定的可行性。

1.2　茶多酚的組分測定

1.2.1高效液相色譜（HPLC）法

對于茶多酚各組分的分析測定，最常用的是高效液相色譜法。其優點是樣品預處理簡單，色譜柱選擇范圍廣，流動相種類和比例可以任意變化，分析時間短，檢測方式多。

首次使用該方法是在1976年，Hoefler[6]等將綠茶用丙酮/水混合液進行預處理，以乙酸/甲醇/N,N-二甲基乙酸銨/水為流動相對兒茶素進行了分析，得到了EGC、C、EC、EGCG、ECG 5種兒茶素和咖啡因含量。

經過不斷研究和發展，于海寧[7]等建立了一種非梯度洗脫的兒茶素定性定量分析方法，得到最佳色譜條件：采用ODS柱，柱溫40℃，以重蒸水:乙睛:乙酸乙酯=86:12:2為流動相，用濃硫酸調節pH值至3～4，流速1 mL/min，UV檢測波長280 nm。

1.2.2毛細管電泳法

利用茶多酚中各組分在電場作用下遷移速率不同的原理，毛細管電泳法也越來越趨于成熟。1997年，Horie[8]等用CZE模式分析了綠茶浸提液，在硼酸鹽的緩沖體系下，200 nm紫外檢測10 min內測出了5種兒茶素和咖啡因、茶氨酸和維生素C。在Bonoli[9]提出的新方法中，使用毛細管電泳法分析了茶多酚成分的靈敏度，該法比HPLC法高20～100倍，使該方法成為食品領域中茶多酚的常規組分分析法。

1.2.3紙色譜法（PC）

Singh[10]等使用Whatman NO.1色譜紙分離了6種兒茶素類化合物，并通過在色譜紙上噴灑重氮化的對氨基苯磺酰胺，使其顯示亮黃色斑點來進行定性分析，但含量則需要將未反應的兒茶素從色譜紙移到試管后，與重氮化的對氨基苯磺酰胺形成絡合物后用分光光度法測量。該方法雖然簡便、成本低、操作方便，但是定量并不精確。

1.2.4近紅外光譜分析技術（NIR）

近紅外光譜是介于可見光和中紅外光之間的電磁波譜。

夏賢明[11]等用近紅外光譜測量了粉碎的綠茶，并對茶多酚建立了多元回歸方程。

2　兒茶素分析

兒茶素又名兒茶酸、兒茶精，是從茶葉中提取出來的一類酚類活性物質。它不僅具有較強的抗氧化性，還具有廣泛的藥理功效，如降血脂、降血糖、防治心血管疾病、預防癌癥、抗菌、抗病毒等。

2.1　兒茶素的含量測定

2.1.1香莢蘭素比色法

兒茶素的總量可通過運用香莢蘭素比色法繪制標準曲線進行測定。其原理是兒茶素和香莢蘭素在強酸條件下生成橘紅到紫紅的產物，顏色的深淺與兒茶素的濃度成正比，以此計算兒茶素的含量。該反應不受花青苷和黃酮苷的干擾，是一種快速的測定方法。

張佳[12]等利用香莢蘭素比色法測得鎖陽中兒茶素含量為11.831 mg/g。

2.1.2高效液相色譜（HPLC）法

黃思勇[13]通過高效液相色譜法檢測分析了恩施硒茶中3種主要的兒茶素成分的含量。色譜條件：以Acclaim 120 C18為色譜柱，以乙腈為流動相A、冰醋酸為流動相B、水為流動相C，柱溫30℃，檢測波長278 nm，進樣量10μL，測得恩施硒茶中兒茶素含量為94.9～147.8 mg/g，平均含量為122.5 mg/g。

2.1.3反相高效液相色譜法

反相高效液相色譜（RP-HPLC）是由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系，它正好與由極性固定相和弱極性流動相所組成的液相色譜體系（正相色譜）相反。RP-HPLC典型的固定相是十八烷基鍵合硅膠，典型的流動相是甲醇和乙腈。

鄒盛勤[14]等建立了茶葉中沒食子酸、兒茶素和表兒茶素的反相高效液相色譜法。色譜條件：以Kromasil C18為色譜柱，流動相為乙腈:水:磷酸=90:10:0.1，流速0.8 mL/min，檢測波長278 nm，柱溫30℃，測得不同茶葉樣品中兒茶素含量最高為6.23mg/g，最低為2.37 mg/g；沒食子酸含量最高為2.84 mg/g，最低為0.84 mg/g；表兒茶素含量最高為4.82 mg/g，最低為0.70 mg/g。

2.1.4紫外分光光度法

管海波[15]等建立了紫外分光光度法測定當歸藤中兒茶素含量的檢測方法，得出以下結論：在檢測波長為280 nm處測定吸光度，計算兒茶素含量；在0.007 81～0.046 86 mg/mL濃度范圍內，兒茶素對照品線性關系良好；平均回收率為98.72%，相對標準偏差為0.09%；當歸藤樣品中兒茶素的平均含量為2.88%。

2.2　兒茶素的結構鑒定

兒茶素單體的測定可以在使用HPLC分離純化后，使用HPLC峰面積歸一化法檢驗兒茶素純化產品的純度，同時根據保留時間來確認初步定性的各兒茶素單體，并得到茶葉中提取的兒茶素單體的含量。若要進行進一步確認，則可以使用UV、IR、HNMR、ESI-MS四譜分析，以此來得到各兒茶素單體的結構。

王洪新[16]等將茶多酚經Sephadex LH-20柱層析分離，并將其中7種兒茶素分成2個流分，再用半制備型HPLC分離純化，用UV、IR、NMR、MS等方法鑒定其化學結構，成功地得到了茶葉中EGC、D-C、EGCG、EC、GCG、ECG、CG 7種兒茶素單體的含量，并用四譜分析確定了它們與相應的兒茶素單體的結構相吻合。

3　黃酮類化合物分析

黃酮類化合物是天然產物中非常重要的一類化合物，它表現出多種生物活性，能防治心腦血管和呼吸系統疾病，具有抗炎、抑菌、降血糖、抗氧化、抗腫瘤以及增強免疫力等多種作用。

黃酮類化合物的基本母核為2-苯基色原酮。天然黃酮類化合物母核上常含有羥基、甲氧基、烴氧基、異戊烯氧基等取代基。茶葉中的黃酮多數能與苷類結合，均屬黃酮醇類，是茶葉水溶性黃色素的主體。

3.1　黃酮類化合物的含量測定

3.1.1分光光度法

分光光度法最早應用于茶葉中黃酮含量的測定，姚小敏[17]等采用紫外-可見分光光度法測定茶葉中黃酮的含量，用95%的乙醇作為提取液，氫氧化鈉作為顯色劑，在500 nm處測定吸光度，最后測定樣品中總黃酮的含量為2.19%。但是，受多種因素的影響，分光光度法容易產生誤差。近些年絡合法成為出現頻率較高的檢測黃酮類化合物的方法。

3.1.2絡合法

絡合法的原理是金屬離子能和黃酮類成分反應，形成有色的絡合物。一般用硝酸鋁-亞硝酸鈉或者三氯化鋁作為顯色劑，生成鋁螯合物，再在分光光度計上測定吸光度，計算含量。

何書美[18]等對硝酸鋁-亞硝酸鈉法和三氯化鋁法測定茶葉中總黃酮含量的結果作了比較。結果表明，硝酸鋁-亞硝酸鈉法的測量結果比三氯化鋁法約高60 mg/g。三氯化鋁法在酸性環境下進行，酸度實驗顯示，其適宜酸度為pH≥5.0。鞣酸干擾實驗表明，平均誤差為0.017 mg，隨鞣酸量的增加，沒有呈現上升趨勢。因此，對含酚類較多的物質應采用三氯化鋁法測定總黃酮含量。

3.1.3高效液相色譜（HPLC）法

陳輝強[19]等用甲醇浸泡，超聲波振蕩提取苦丁茶中的黃酮類化合物，提取物選用Hypersil C12反相柱，以甲醇:水:冰乙酸=40:60:1為流動相，采用高效液相色譜法測定提純后黃酮類化合物的含量。

王懷沖[20]等采用高效液相色譜法，以C18為固定柱，甲醇:0.025 mol/L磷酸溶液=50:50為流動相，363 nm為檢測波長，測定了貫葉連翹提取物中金絲桃苷的含量。

高效液相色譜法方便簡單，分離效果好。但是，其不足之處在于需要和高純度的標準品對照或者和文獻資料對比，不適用于新物質的結構定性。因此，將HPLC與NMR、MS、UV、CD等多種光譜學技術聯用成為研究學者采用較多的研究手段。

3.1.4電化學法

電化學法建立在待測黃酮類化合物的電化學性質上，主要包括庫侖滴定法、極譜法、離子選擇電極法。

余紅[21]采用庫侖滴定法，以羥基紅花黃色素為對照品，測定了北京、南昌、溫州以及開封4個產地的紅花樣品中的總黃酮含量。

3.1.5毛細管電泳法

毛細管電泳法是一種以毛細管為分離通道、高壓直流電場為驅動力的新型液相分離技術，具有靈敏度高、分離效率高、經濟、快速等優點，適用于黃酮類化合物的快速定量分析。

吳婷[22]將毛細管電泳法與電化學檢測技術結合起來，同時測定益母草以及3種益母草沖劑中橙皮素、根皮苷、山奈素、蘆丁、洋芹素及槲皮素6種黃酮類化合物的含量。

3.1.6熒光法

黃酮類化合物屬于平面共軛大分子，在紫外光照射下有強烈的熒光發射，從而可以通過熒光的強弱來分析黃酮類化合物的含量。

牟蘭[23]等應用熒光法，以495 nm為發射波長、433 nm為激發波長，測定了蜂膠中總黃酮的含量。

3.2　黃酮類化合物的結構鑒定

3.2.1顏色反應法

黃酮類化合物中的酚羥基和苯并吡喃酮環可與鎂鹽、鋁鹽、鐵鹽以及硼酸、堿性試劑發生顯色反應，通過觀察生成物的特殊顏色，初步分析黃酮類化合物。

常見的顏色反應有鹽酸鎂粉反應、氯化鋁反應、氫氧化鈉反應等。

3.2.2平板色譜法

平板色譜法主要包括薄層色譜法和紙色譜法。薄層色譜一般有硅膠薄層和聚酰胺薄層。硅膠薄層常用于分離和鑒定大多數黃酮苷元；聚酰胺薄層適用范圍廣，尤其適用于分離和鑒定具有游離酚羥基的黃酮苷類及苷元。紙色譜常用于鑒定植物粗提取物中的黃酮苷類和苷元的混合物。

李彩君[24]等以正己烷-乙酸乙酯-冰乙酸（10:1:0.5）為展開劑，高良姜素為對照品，建立了高良姜藥材的薄層色譜定性鑒別法，高良姜素、山奈素等8個熒光斑點構成了高良姜乙酸乙酯提取部位的薄層色譜指紋圖譜。

3.2.3紫外-可見分光光度法

紫外-可見分光光度法是鑒定黃酮類化合物的一種重要手段。首先測定試樣在甲醇溶液中的紫外光譜，再測定試樣在甲醇溶液中加入各種診斷試劑后的紫外光譜，黃酮苷類可在水解后測定苷元或衍生物的紫外光譜。黃酮類化合物主要有帶Ⅰ（300～400 nm）和帶Ⅱ（220～280 nm）兩個吸收帶，黃酮類化合物的結構不同，其帶Ⅰ和帶Ⅱ的峰形、峰位以及峰強都不同。因此，可以推測出黃酮類化合物的結構。

3.2.4核磁共振波譜法

核磁共振波譜包括氫譜和碳譜。根據氫質子共振吸收峰化學位移、偶合常數和峰面積等特征信息，可以獲取黃酮類化合物的母核類型以及取代基種類、位置和數量等。

張紅梅[25]等從卷柏中分離出5個雙黃酮類化合物，并利用核磁共振波譜法對其進行了結構鑒定。通過對卷柏屬中雙黃酮類化合物核磁共振特征的研究，首次歸納出卷柏屬雙黃酮類化合物核磁共振碳譜和氫譜的特征。

4　花青素分析

花青素是自然界中廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，也是植物花瓣中的主要呈色物質，花青素具有清除自由基、抗氧化、抗突變、降血壓、改善肝機能等多種生理功能。花青素屬于酚類化合物中的類黃酮類，基本結構包含2個苯環，并由1個3碳的單位連結（C6-C3-C6）。花青素不穩定，自然界中少有游離的花青素，大多以糖苷化和酰基化的形式存在，統稱為花色苷。

4.1　花青素的含量測定

4.1.1高效液相色譜（HPLC）法

20世紀70年代初，有研究者開始利用HPLC對花青素類物質進行單組分成分的定性和定量研究。

Ka¨hko¨nen[26]等采用HPLC法對越橘、黑醋栗、牛莓總花青素含量分別進行了測定。

岳喜慶[27]等將HPLC與分子質量校正系數計算方法結合，對樣品中具有對應母環的花青素進行了定量計算，獲得了更為精確的結果。

然而，由于花青素糖苷化和酰基化的多樣性，如果采用色譜法檢測，需要多種標準品，成本高，再加上花青素核在可見光500～550 nm處強烈吸收，糖苷化和酰基化對其可見光譜性質的影響不大，使得可見分光光度法成為一種比較方便的檢測花青素的方法。常見的分光光度法有色價法和pH示差法。

4.1.2色價法

色價法是我國常用的測量花青素含量高低的一種快速定性方法。色價指的是單位質量原料提取物的吸光度。該方法操作簡單且不需要標準品，具體操作是用移液管吸取2 mL樣品液，加入18 mL、pH=3.0的緩沖液后混勻，再將2 mL溶劑加入18 mL緩沖液混勻作空白樣品，紫外分光光度計在250～600nm范圍內掃描，測定待測液的最大吸收波長，并在其最大吸收波長處測定樣品的吸光度[28]。按照公式E=A×10×a/W計算色價，其中，E為色價，A為峰值下的吸光度，W為取樣量，a為樣品液的稀釋倍數。

4.1.3pH示差法

pH示差法的原理是花青素的色調隨pH的變化而變化，但其他干擾物質卻不受影響。花青苷在pH為1.0時，生成特有的剛果紅，pH為4.5時變為無色。在這兩個pH值之間，花青素的吸光度與花青素的含量成正比[29]。

楊萍[30]等將pH示差法與HPLC法測定黑枸杞花青素進行了比較，通過測定波長、緩沖液pH、平衡溫度和平衡時間影響因素的研究，選擇pH示差法為測定方法，最優實驗參數為測定波長525 nm、環境pH值為1.0和4.5、平衡溫度40℃。pH=1.0時的平衡時間為30 min，pH=4.5時的平衡時間為20 min，測得的花青素含量為60.59 mg/L，與HPLC法測定的結果60.94 mg/L非常接近，準確度高，且方便快捷，成本低，更加適用于花青素的含量測定。

4.1.4紫外分光光度法

紫外分光光度法的原理是花青素在指定波長處有特征性吸收峰，吸收峰的高度和面積與濃度呈正比，用已知含量的花青素標準品對照，根據標準曲線即可得到樣品中花青素的含量。我國學者利用該方法測定了玫瑰花[31]、茶樹芽葉[32]、葡萄酒[33]、紫色馬鈴薯[34]等的花青素含量。由于受到其他化合物的干擾，該方法只適用于純度較高或干擾含量低的花青素溶液，適用范圍較窄。

4.2　花青素的結構鑒定

4.2.1顯色反應法

張海悅[35]等將紙層析純化后的黑葵花籽殼花色苷樣品分別溶于50%乙醇溶液，加入少量鎂粉后再加入幾滴濃鹽酸，溶液產生大量氣泡，顏色變深；若只加鹽酸，則無氣泡，由此可證明該物質為黃酮類化合物。加入幾滴萘酚乙醇溶液后再加入幾滴濃硫酸，靜置片刻后，溶液與濃硫酸交界處有紫色的環，溶液層為紅色，濃硫酸層為淡綠色，表明含有糖類物質，與花色苷顯色特征一致。

4.2.2紫外可見光譜分析法

花色苷及其色素元在可見光465～550 nm、紫外光275 nm處有吸收峰[36]。通過測定樣品的紫外-可見光譜，可判斷為花色苷類物質。

張海悅[35]等在黑葵花籽殼花色苷樣品溶液中加入3～5滴5 mol/L的三氯化鋁-甲醇溶液后，最大吸收波長出現紅移現象，說明花色苷B環上含有2個相鄰的羥基。

4.2.3紙層析法與薄層層析法

根據花青素類物質在不同溶劑中遷移值和顏色的不同，可對其進行定性分析。該方法成本低、設備簡單，并且直觀性和可比性好。

王本曉[37]等用薄層層析法分析得到玫瑰花中主要的花青素為矢車菊素-3,5-二葡糖糖苷。

王娜[38]等用紙層析法對樟樹果的花青素組成進行了初步鑒定。

4.2.4紅外光譜分析法

王瓊[39]等采用沉淀法輔助提純七彩菊中的花青素，研究發現紅外吸收光譜中，在3 392.70 cm-1的較強吸收峰，是締合O-H產生；1 653 cm-1處的吸收峰，為C=O結構；1 617 cm-1和1 507 cm-1處的吸收峰，為苯環特征峰；1 457 cm-1處的吸收峰，為CH2結構；1 339 cm-1處的吸收峰，為CH3結構；1 187 cm-1、1 078 cm-1、1 118 cm-1處的吸收峰，可能是C-O-C結構，這些可能的結構均體現了花青素類結構中的相關基團特征。

5　酚酸類化合物分析

茶葉中的酚酸類化合物含量較少，但包括沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、對香豆酸、鞣花酸、奎尼酸、茶沒食子素等多種成分[40]，并且各組分都具有特殊的功能。例如，綠原酸具有利膽、抗菌、降壓、增高白血球及興奮中樞神經系統等多種作用[41]；沒食子酸可用于有機合成，作為食品抗氧化劑、防腐劑、消毒劑以及葡萄生長劑等[42]。

5.1　酚酸類化合物的含量測定

5.1.1高效液相色譜（HPLC）法

江和源[43]等建立了茶葉中的酚酸類化合物的高效液相色譜法的測定方法，并通過一系列優化實驗，分析比較了茶葉中酚酸類化合物的前處理方法，得出茶葉中酚酸類化合物的HPLC測定方法條件為：以Hypersil BDS C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）為色譜柱，75%A液（2%HAc）+25%B液（甲醇）為流動相，柱溫30℃，流速1.0 mL/min，檢測波長326 nm，通過外標法定量檢測。

5.1.2普魯士蘭法

普魯士蘭法是比較經典的測量酚酸含量的顯色方法，該方法采用十二烷基硫酸鈉-FeCl3-K3[Fe（CN）4]-HCl系統進行顯色，具有操作簡單、快速、經濟、重現性好等優點。不同文獻報道的普魯士蘭法顯色劑用量不同，所以實驗前要優化顯色條件。

劉麗金[44]等在核桃殼中的酚酸含量測定實驗中，確定最佳顯色條件為：無水乙醇5.0 mL，0.3%十二烷基硫酸鈉溶液1.5 mL，0.6%FeCl3-0.9%K3[Fe（CN）4]混合液2.0 mL，暗處放置50 min。

5.1.3聯用技術

目前，氣質聯用（GC-MS）、高效液相色譜-二極管陣列（HPLC-PDA）、高效液相色譜-二極管陣列-質譜（HPLC-PDA-MS）等技術可以快速實現對樣品的定性定量分析，GC-MS因其主要用于揮發性成分的分析，故不常用來對酚酸類物質進行定性定量分析。HPLC-PDA可能因加入某種診斷試劑而造成化合物難以分離與辨認，因此也不適用于酚酸類物質的分析。HPLC-PDA-MS是一種較為先進的技術，且有學者利用此方法對酚酸類物質進行了含量測定。

于東[45]等采用高效液相色譜-二極管陣列-質譜技術，對紫山藥中酚酸類化合物進行了含量測定，測得紫山藥中可溶態酚酸芥子酸含量為356.71μg/gDW，不溶態酚酸阿魏酸含量為26.92μg/g DW。

5.2　酚酸類化合物的結構鑒定

酚酸類化合物可通過1H-NMR、3C-NMR、MS等譜學技術對其進行結構鑒定。

吳瓊[46]等通過NMR和MS等譜學技術分析確定了從刺五加葉中分離純化得到的化合物結構，參考測得的波譜數據與文獻波譜數據，測得從刺五加葉提取物中分離得到的8個酚酸類化合物，分別為咖啡酸、阿魏酸、原兒茶酸甲酯、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、丁香酸、綠原酸、松柏苷。

6　結語

茶葉中的化學物質因其生理活性和藥理價值越來越受到關注。通過對茶葉分離后得到的各種化學成分的含量測定研究發現，茶多酚中的兒茶素多以高效液相色譜法、黃酮類化合物多以絡合法、其余則多以分光光度法繪制標準曲線為主，測定各組分含量，其主要優點是操作簡便，對設備要求低。而對其結構鑒定多用光譜、質譜和核磁共振波譜法分析，光譜中最常用的則是紫外光譜法，多譜聯用也是結構鑒定常用的方法之一，這些圖譜為我們準確推測化學物質的結構提供了很大的便利。利用官能團性質的顏色反應，也能幫助我們初步分析部分成分的結構。

當然，隨著科學技術的不斷提高，有越來越多的研究者在原有的方法上進行了改進，或尋找效率更高、成本更低、操作更簡便、結果更精確的新方法。這些新方法是否能在工業上使用，還需要進一步研究探索。