呼吸道合胞病毒感染患兒外周血單個核細胞Toll 樣受體的表達及意義

李 珂

呼吸道合胞病毒是引發全球范圍內小兒急性下呼吸道感染的主要病原體，毛細支氣管炎和肺炎等是由其引發的常見疾病類型，診治不及時將引發呼吸衰竭甚至死亡，有數據報告顯示全球每年有7～20 萬例5 歲以下兒童死于急性下呼吸道感染，帶給家庭及社會沉重的經濟負擔[1]。呼吸道合胞病毒主要侵襲患兒呼吸道，誘導呼吸道上皮細胞分泌細胞因子及趨化因子等炎癥因子，引發器官以及支氣管痙攣等氣道高反應性，從而危害嬰幼兒生命健康[2]。Toll 樣受體（TLRs）是連接天然免疫以及獲得性免疫的模式識別受體，能特異性地識別來源于特定類型微生物中保守結構的分子，通過對細胞信號傳導途徑進行激活，從而激活固有免疫反應，在機體建立特異性免疫中發揮重要作用[3]。有文獻報告指出TLRs 在代謝綜合征患者、慢性乙型肝炎患者中發揮重要作用[4]，國外學者研究則表明TLRs 及其信號通路在宿主感染呼吸道合胞病毒后發揮著重要作用[5]，本研究旨在探討呼吸道合胞病毒感染患兒外周血單個核細胞（PBMCs）上TLRs 的表達及意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料 以2016年3月～2018年3月我院收治的65例呼吸道合胞病毒感染患兒（記為觀察組）和同期在我院體檢的35例健康兒童（記為健康組）為研究對象，患兒納入標準：①患兒入院后經呼吸道分泌物檢測提示呼吸道合胞病毒抗原陽性；②年齡≤12 歲；③未合并先天性心臟病、免疫缺陷及支氣管發育不良等疾病。排除標準：伴有細菌或衣原體等其他病原體感染者。健康兒童納入標準：①年齡≤12 歲；②既往無呼吸道合胞病毒感染史；③既往無細菌或衣原體等病原體感染史。觀察組65例，男36例，女29例，年齡4～12 歲，平均（7.26±2.03）歲；健康組35例，男19例，女16例，年齡4～11 歲，平均（8.01±2.01）歲。兩組性別、年齡基線資料相比較無明顯差異（P＞0.05），有可比性。

1.2 研究方法 ①臨床資料收集：采用我院自制調查問卷對納入研究對象的臨床資料進行調查，主要調查納入對象性別、年齡、體質指數（BMI）、炎癥因子[白介素-6（IL-6）、白介素-17（IL-17）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α），采用放射免疫分析法檢測IL-6、IL-17；雙抗體夾心法檢測TNF-α 水平，試劑由福建邁特生物工程有限公司提供]水平。②外周血單個核細胞制備：采集納入研究對象外周血，采用肝素抗凝，密度梯度進行離心以獲得PBMCs，將其懸浮于1640 培養基(由10%的胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml、L-谷氨酰胺1.5mM組成)，最后調整細胞濃度為1×106/ml，采用臺盼藍實驗評估細胞存活狀態(＞98%)。③外周血單個核細胞中TLRs 檢測，外周全血肝素抗凝，紅細胞裂解液加入，10min 后離心，1ml PBS 液重復洗滌細胞兩次，每管加入20μl PE 標記的鼠抗人TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 單抗(由北京中山生物公司提供)，混勻后室溫遮光孵育0.5h，PBS 洗滌液洗滌一次后，將熒光染色的細胞離心沉淀，每只管內加入多聚甲醛固定10min 后，將其放在4℃處保存待用，離心后將上清液去掉，采用PBS 液對細胞密度進行調整，最終調整為2×109/L；采用 TR Lzol 法提取細胞總RNA，依據反轉錄試劑盒說明書操作步驟將RNA 反轉錄為cDNA，適當比例稀釋后，行熒光定量PCR 擴增，內參物為GAPDH，反應條件:95℃各10min、15s，55 ℃1min，72 ℃10s，共重復38個循環；TLR 相對表達量以TLR 與內參物GAPDH 表達量的比值進行表示；每個樣本設3 個重復孔，取平均值，引物（上海生工合成）序列：TLR-3上游引物5'-GCCTCTCCAAGGAAGAATCC-3'，下游引物5'-TCCTGTTGTTGGACAGGTCA-3'；TLR-4 上游引物5'-AATCTAGAGCACTTGGACCTTTCC-3'，下游引物5'-GGGTTCAGGGACAGGTCTAAAGA-3'；TLR-7上游引物 5'-AAGAAAGGTTCCCGCAGACTT-3'，下游引物5'-TGTTATGGCATAGAATCAAAACTCTCA-3'；TLR-9 上游引物 5'-GGACCTCT-GGTACTGCTTCCA-3'，下游引物5'-AAGCTCGTT-GTACACCCAGTCT-3'；GAPDH上游引物5'-AGAAGGCTGGGCTCATTTG-3'，下游引物 5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0 軟件分析處理研究數據，計量資料以±s 表示，組間對比行獨立樣本t 檢驗，計數資料以率（%）表示，組間對比行χ2檢驗，符合正太分布計量資料間行Pearson 相關性分析，數據間回歸分析采用多元Logistic 回歸分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。均行雙側檢驗。

2 結果

2.1 兩組臨床資料比較 兩組性別、年齡、BMI 相比無明顯差異（P＞0.05）；觀察組IL-6、IL-17、TNF-α較健康組明顯高，差異顯著（P＜0.05），見表1。

2.2 兩組PBMCs TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 的表達水平 觀察組PBMCs TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 表達水平較健康組明顯高，差異顯著（P＜0.05），見表2。

2.3 觀 察 組TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 與 臨 床指標的相關性分析 以呼吸道合胞病毒感染患兒PBMCs TLRs 為應變量，以年齡、性別、BMI、IL-6、IL-17、TNF-α 等為自變量，進行多元逐步回歸分析，IL-6、IL-17、TNF-α 代入回歸方程（P＜0.05），常數項為0。相關性分析提示呼吸道合胞病毒感染患兒IL-6、IL-17、TNF-α 水平與TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 表達水平均呈明顯正相關（P＜0.05），而患者性別、年齡、BMI 與TLR3、TLR4、TLR7、TLR9無明顯相關性（P＞0.05），見表3。

表1 兩組臨床資料比較（±s）

項目 + 觀察組（n=65）健康組（n=35） t/χ2 P性別（男/女） 36/29 19/16 0.011 0.916年齡（歲） 7.26±2.03 8.01±2.01 1.768 0.080 BMI（kg/m2） 16.98±3.05 17.01±3.08 0.047 0.963 IL-6（ng/L） 315.26±24.14 102.31±32.87 36.955 0.000 IL-17（ng/ml） 321.62±31.13 192.58±19.18 22.319 0.000 TNF-α（ng/L） 25.16±6.12 2.87±1.01 21.343 0.000

表2 兩組PBMCs TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 的表達水平（±s）

表2 兩組PBMCs TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 的表達水平（±s）

組別 TLR3 TLR4 TLR7 TLR9觀察組（n=65）0.13±0.04 0.14±0.05 0.15±0.05 0.16±0.06健康組（n=35）0.07±0.02 0.08±0.02 0.07±0.03 0.08±0.03 t 8.318 6.800 8.652 7.394 P 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 觀察組TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 與臨床指標的相關性分析

3 討論

呼吸道合胞病毒是有胞膜非片段的單股負鏈RNA 病毒，常侵襲兒童的呼吸道，其發病機制為呼吸道合胞病毒通過誘導呼吸道上皮細胞分泌細胞因子以及趨化因子等炎癥因子，引發氣管以及支氣管痙攣最終導致氣道高反應，呼吸道合胞病毒是目前引發嬰幼兒下呼吸道感染的常見病原體[6]；而TLRs 是目前臨床中用以連接天然免疫及獲得性免疫的模式識別受體，其可激活細胞信號通路途徑和機體固有免疫反應[7]，有研究指出TLRs 在宿主感染呼吸道合胞病毒中發揮重要作用[8]，臨床積極探究呼吸道合胞病毒感染患兒PBMCs TLRs 的表達及意義，為防治兒童呼吸道合胞病毒感染性疾病提供理論依據。本研究結果發現：觀察組IL-6、IL-17、TNF-α 較健康組明顯高，觀察組PBMCs TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 表達水平較健康組明顯高，相關性分析提示呼吸道合胞病毒感染患兒IL-6、IL-17、TNF-α 水平與TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 表達水平均呈明顯正相關，IL-6、IL-17、TNF-α、TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 在呼吸道合胞病毒感染患兒中發揮著重要作用。

TLRs 為Ⅰ型跨膜受體蛋白，主要包含胞外區、跨膜區以及胞內區組成，而TLRs 的胞內區與IL-1R 家族各成員胞內區同源，有200 多個氨基酸組成，稱為Toll/IL-1 受體結構域（TIR 結構域），TIR有嗜同性相互作用，是TLRs 向下游進行信號傳遞的樞紐[9]；本研究結果提示呼吸道合胞病毒感染患兒炎癥因子IL-6、IL-17、TNF-α 與TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 呈明顯正相關，表明TLRs 在呼吸道合胞病毒感染患兒中發揮重要作用，呼吸道合胞病毒感染在轉錄及翻譯過程中可產生大量的雙鏈RNA，可特異性地被TLR3 識別，早期文獻報道指出通過TLR3 激活的嗜酸性粒細胞可募集白細胞聚集于炎癥部位，此外TLR3 在過敏性鼻炎以及過敏性氣道炎癥中呈弱表達，可推斷TLRs 在呼吸道合胞病毒感染中發揮重要作用[10]。呼吸道合胞病毒感染可引發TLR4 表達量明顯升高，在增強呼吸道上皮細胞對脂多糖的敏感性中發揮重要作用，機體上皮細胞感染呼吸道合胞病毒后，TLR4 的信使RNA 及蛋白表達明顯上調，與之相關的炎癥因子水平也隨之明顯升高，早期研究也證實TLR4 及其信號通路可能參與了呼吸道合胞病毒誘導的上皮細胞急、慢性炎癥反應[11]。TLR7 對感染呼吸道合胞病毒后的免疫效應與TLR3 是類似的，兩者都可上調信使RNA及其蛋白表達，既往動物實驗研究也表明TLR7 作用的小鼠其炎癥因子IL-23 和IL-12 水平明顯升高[12]，這也證實了TLR7 在呼吸道合胞病毒感染疾病發生中有重要作用。而TLR9 同樣參與了呼吸道合胞病毒感染過程中，其可上調感染呼吸道合胞病毒者TNF-α 水平，引發炎癥性疾病，這與既往文獻報道相符[13]。由本次研究結果我們可推測TLRs 在啟動宿主細胞對病毒的固有免疫、調節機體建立特異性免疫中作用顯著，機體感染呼吸道合胞病毒可與不同TLRs 特異性結合，誘導下游炎癥因子等的分泌，引發炎癥性疾病[14]。

綜上所述，PBMCs TLRs 的表達在呼吸道合胞病毒感染性疾病中發揮重要作用，為呼吸道合胞病毒感染患兒新型治療藥物的開發提供參考信息。