東北自然發酵酸菜中耐低溫優良乳酸菌菌種的篩選

張曉黎 吳興壯 高雅

摘要：在10 ℃低溫狀態下，利用分離得到的乳酸菌菌種開展應用試驗。接種白菜進行發酵，在發酵過程中分別測定菌種產酸速度、產酸量、降解亞硝酸鹽能力和乳酸菌素產量，以成品酸菜風味為最終考核指標，篩選出2株產酸速度快、耐酸強、降解亞硝酸鹽能力強、乳酸菌素產量高的耐低溫乳酸菌菌株。

關鍵詞：酸菜;乳酸菌;菌種篩選;耐低溫

中圖分類號：TS201.3? ?文獻標識碼：A? ? 文章編號：1674-1161（2018）05-0020-03

乳酸菌是酸菜發酵過程中起主要作用的微生物菌群，其生物學特性和發酵特性直接影響著酸菜的發酵效果。采用低溫乳酸菌發酵生產酸菜，可以獲得酸味柔和、風味飽滿的酸菜。乳酸菌作為中溫型微生物，一般在低于15 ℃的條件下生長緩慢，在10 ℃以下生長微弱、甚至很難生長。目前酸菜工業化生產所應用的乳酸菌菌種多數為常溫下分離所得，適宜的發酵溫度為22～30 ℃，低于10 ℃其生長受到抑制。在東北地區，發酵酸菜所用的大白菜大多在10月中下旬大量采收，此時外界氣溫一般已經降到15 ℃以下，最低氣溫甚至達到0 ℃左右。采用人工接種乳酸菌生產酸菜，必須人為提高生產環境溫度，才能充分發揮乳酸菌菌種優勢，導致能源消耗大、生產成本高。因此，目前東北地區的酸菜生產以自然發酵為主，發酵過程中除了乳酸菌外還有其他微生物同時繁殖生長，為了防止酸菜產品漲袋，往往需要人為添加防腐劑，產品質量無法保證，對酸菜產業良性發展極為不利。

本課題以東北農家低溫自然發酵酸菜中分離、鑒定的乳酸菌菌種為研究對象，經過馴化篩選獲得性能優良的耐低溫乳酸菌菌種，為低溫環境條件下規模化生產酸菜提供可靠、便捷的乳酸菌菌種，可以縮短低溫環境條件下酸菜生產周期，提高生產效率，降低生產成本，且充分發酵后產品無需添加防腐劑，確保產品品質和食用安全性，為乳酸菌發酵酸菜規模化生產提供了有效的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 乳酸菌菌種 L1，L2，L3，L4，L5：從低溫自然發酵酸菜中分離鑒定保存的耐低溫乳酸菌菌種。

1.1.2 培養基配方 MRS培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，K2HPO4 2 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，加蒸餾水至1 000mL，調節pH值為6.5，121 ℃下滅菌20 min。酸菜生產種培養基：200 g白菜，50 g白糖，加水1 000 mL，水燒開后小火煮30 min，然后將白菜濾出，濾液調節pH值為6.5，121 ℃下滅菌20 min。

1.2 儀器設備

SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司;BL-100G型全自動立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業有限公司醫療設備廠;XSP-580A型生物顯微鏡：上海中恒儀器有限公司;756型紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司;PHS-3C型精密酸度計：上海曉霄試驗設備儀器有限公司;GDYQ-901SC2型食品亞硝酸鹽快速測定儀：長春吉大小天鵝儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 低溫乳酸菌的馴化 將5株乳酸菌菌種（L1，L2，L3，L4，L5）分別接入MRS液體培養基中，放置于冰箱中，依次在15，13，11，9 ℃下培養，使其逐步適應低溫環境。然后以經過低溫馴化的菌種作為種源進行后續試驗。

1.3.2 供試菌株產酸能力的測定 將5株乳酸菌菌種（L1，L2，L3，L4，L5）分別接入MRS培養基中進行擴繁，然后將待測菌株的培養液以相同的接種量（1%）接入酸菜生產種培養基中，在10 ℃下培養，每隔2 h取樣，測定培養液的pH值，觀察產酸情況;用紫外分光分度計在波長600 nm下測定培養液的吸光度值（OD值），根據培養液的渾濁程度來判斷菌株生長情況。每個處理重復3次，取平均值。

1.3.3 供試菌株降解亞硝酸鹽能力的測定 將5株乳酸菌菌種（L1，L2，L3，L4，L5）依次接種到MRS培養基和酸菜生產種培養基中進行擴繁，然后將生產種接入白菜中壓實密封，置于10 ℃的低溫環境下發酵，每隔2 d監測其亞硝酸鹽含量，判斷其降解亞硝酸鹽的能力。

1.3.4 供試菌株乳酸菌素產量的測定 乳酸菌素是由乳酸菌生長過程中產生的一種具有活性的多肽或蛋白質，有一定的抑菌作用。通過測量抑菌圈的大小來判斷乳酸菌素的含量。采用瓊脂擴散法，以金黃色葡萄球菌為指示菌，將受試致病菌懸液均勻涂布于營養瓊脂平板（厚度4 mm）上，然后在瓊脂上打孔（孔徑5 mm）并封底，將5株待測菌株的代謝產物加滿孔中，培養24 h后測量抑菌圈直徑，根據抑菌圈大小判斷其抑菌效果，從而推斷其產生乳酸菌素的含量。每個處理重復3次，取平均值。

1.3.5 供試菌株發酵酸菜的感官評價 將5株乳酸菌菌種（L1，L2，L3，L4，L5）按照1.3.3的方法進行擴繁，接入白菜發酵一個月后，對酸菜的風味、口感、色澤、質地進行評價。評分標準：風味，有發酵的酸香味為5分，酸味刺鼻為0分;口感，酸爽可口為5，酸味不正為0分;色澤，淺黃有光澤為5分，灰暗無光澤為0分;質地，脆嫩為5分，質地發軟為0分。

2 結果與分析

2.1 供試菌株產酸能力

不同菌株發酵過程中發酵液pH值變化情況見表1。

由表1可知：L1發酵前期產酸較快，后期產酸尚可;L3和L5前期產酸較慢，但后期產酸較好;L2整個發酵過程中產酸情況都不理想;L4較L2稍好，但比L1，L3，L5較差。

2.2 供試菌株生長情況

不同菌株發酵過程中發酵液光密度值（OD值）變化情況見表2。

由表2可知：L1，L3發酵初期生長速率較快，發酵后期尚可;L5雖然前期生長較慢，但后期生長速度較快，甚至超越了L1。

2.3 供試菌株不同發酵時期亞硝酸鹽含量

不同菌株發酵過程中亞硝酸鹽含量測定情況見表3。

由表3可知：L3在發酵26 d時，亞硝酸鹽含量最低;L1與L5稍微高一點，但區別不大;L2和L4較差，但均遠低于國標規定的亞硝酸鹽含量。

2.4 供試菌株代謝產物乳酸菌素含量的測定

不同菌株抑菌圈大小測定結果見表4。

由表4可知：L3抑制葡萄球菌效果較好;L1與L5抑菌效果尚可;L2和L4抑菌效果較差。

2.5 供試菌株發酵酸菜的感官評價

不同菌株發酵酸菜的品質評價情況見表5。

由表5可知：L1最好，L3和L5稍差，但明顯優于L2和L4。

綜合以上各組試驗結果以及酸菜品質評分情況，從5株分離鑒定的乳酸菌種中篩選出各項性能指標良好、發酵酸菜品質優良的乳酸菌菌種為L1和L3。

3 結論

本試驗篩選的耐低溫乳酸菌菌種可以在酸菜發酵期間降低對環境溫度的要求，從而為企業節省能源、降低成本;并且通過篩選得到各項性能優良的乳酸菌菌種，可以保證生產出的酸菜無論品質還是安全性都大大提高。對于目前采用自然發酵生產酸菜的企業而言，應用乳酸菌菌種發酵改進酸菜生產工藝，與以往添加防腐劑相比，并不會增加成本，同時可縮短生產周期，提高產品質量，使酸菜更加營養、安全、美味;對于目前利用乳酸菌接種生產酸菜的企業而言，應用耐低溫乳酸菌菌種可以大大降低能耗，減少生產成本，增強市場競爭力。耐低溫乳酸菌菌種的篩選，有利于直投式乳酸菌酸菜的推廣，可以在很大程度上提高酸菜產品的安全性，對于有效促進酸菜行業健康有序發展具有深遠意義。

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Screening of Lactic Acid Bacteria Resistant to Low Temperature

Pickled Cabbage by Natural Fermented in Northeast China

ZHANG Xiaoli， WU Xingzhuang， GAO Ya

（Institute of Food and Processing， Liaoning Academy of Agricultural Sciences， Shenyang 110161， China）

Abstract： In the condition of 10 ℃ low temperature， the isolated lactobacillus strains were used to carry out the application test. Inoculated cabbage was fermented. In the fermentation process， the acid production rate， acid production amount， nitrite degradation capacity and lactobacillus production were determined. Taking the flavor of finished pickled cabbage as the final evaluation index， 2 strains of low-temperature lactic acid bacteria with fast acid production speed， strong acid resistance， strong ability to degrade nitrite and high lactobacillus production were screened out.

Key words： pickled cabbage; lactic acid bacteria; bacteria screening; low temperature resistant