整合素α2β1 和CD44V3 表達與宮頸鱗癌臨床病理關系探究

尤 鑫 趙向寨 楊 雪 溫彥靜

1．天津市中心婦產科醫院( 300100) ;2．河北醫科大學第三醫院;3．河北省中醫院

宮頸鱗癌是女性［1］發展隱蔽，確診時已不同程度的浸潤、轉移，尋找宮頸鱗癌的早期診斷指標尤為重要。宮頸鱗癌的浸潤、轉移涉及多種基因的調控，腫瘤細胞之間以及與基質間的黏附力改變、腫瘤細胞的遷移與增生能力以及血管的形成等。其發生主要因素是細胞間黏附力的變化及癌細胞與細胞外基質和基底膜的相互作用［2-3］。所以，細胞黏附分子在腫瘤細胞的浸潤、轉移中發揮了重要作用。整合素α2β1 作為黏附分子，主要通過調節細胞黏附和遷移而提高腫瘤的轉移能力。黏附分子CD44V3，也能介導細胞與細胞之間及細胞與細胞外基質的黏附，促進腫瘤細胞浸潤、轉移及擴散［4］。整合素α2β1、CD44V3 在腫瘤的發生、發展，尤其是浸潤與轉移的過程中起著重要的作用。本研究探討宮頸鱗癌組織和宮頸非癌組織中上述指標蛋白表達差異在宮頸鱗癌發生、發展中的作用。同時，采用逆轉錄-聚合酶鏈反應( RT-PCR) 技術檢測兩者在組織中mRNA 的表達，從基因水平探討其與宮頸鱗癌發生發展關系。

1 資料與方法

1．1 基本資料

收集2015 年1 月—2017 年1 月間本院病例標本72 例，其中確診［5］為宮頸鱗癌標本36 例( 宮頸鱗癌組) ，年齡( 55．4±6．8) 歲( 34～68 歲) ;角化型16例，非角化性型20 例;PTNM 分期I ～II 期19 例，III～IV 期17 例;淋巴轉移25 例，無淋巴轉移11 例;浸潤深度T1～T216 例，T3～T4 20 例;患者術前均未接受放化療。同期子宮平滑肌瘤手術切除的良性病變宮頸黏膜組織標本36 例( 對照組) ，年齡( 56．0±5．7) 歲( 32～73 歲) ，所有臨床資料完整，兩組年齡比較無差異( t=0．418，P=0．677) 。本研究得到本院倫理委員會的批準。

1．2 實驗方法

1．2．1 標本處理 手術切除組織標本后，部分標本10%中性福爾馬林溶液固定，逐級脫水、透明、常規石蠟包埋，連續切片，用于免疫組化SP 法染色實驗;另一部分標本立即儲存于-80℃冰柜中，用于提取RNA，行RT-PCR。

1．2．2 RT-PCR 檢測 檢測兩組標本中整合素α2β1 mRNA、CD44V3 mRNA 的表達。組織標本立刻置于-80℃冰柜備用，提取總RNA，通過反轉錄及基因擴增合成整合素α2β1 和CD44V3 基因片段，瓊脂糖凝膠電泳，并經成像系統采圖，用Quantity One 軟件分析其相對表達量。

1．2．3 檢測結果分析 使用β?actin 作內參照，將擴增產物用1．5%瓊脂糖凝膠電泳，通過成像系統Quantity One 采圖后進行相對表達量分析。

1．3 陽性表達判定［6-7］

整合素α2β1 和CD44V3 的陽性水平采用陽性細胞數評分及染色強度評分綜合判定。陽性細胞數評分:×200 倍顯微鏡下，隨機4 個視野( 每個腫瘤細胞計數100 個) ，染色并統計陽性細胞記分，陽性細胞率＜10%為0 分，10%～25%為2 分，26%～50%為2 分，＞50%為3 分;染色強度評分，與背景色一致為0 分( 陰性) ，略深于背景色為1 分，中等黃色為2分，呈棕黃色或棕褐色( 且細胞漿也著色) 為3 分。綜合判定:0 分為( -) ，1～2 分為( +) ，3 ～4 分為( ++) ，5～6 分為( +++) 。

1．4 統計學分析

使用SPSS19．0 統計軟件進行數據分析，蛋白水平計算率，組間比較采用檢驗; 基因水平計算均數±標準差，組間比較使用t 檢驗; 整合素α2β1 和CD44V3 相關性采用Spearman 分析。P＜0．05 為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 宮頸鱗癌組整合素α2β1 和CD44V3 的表達

電泳圖中可見在198bp 和100bp 處有特異性反應條帶，分別是整合素α2β1 和β?actin 的電泳片段，以整合素α2β1 和β?actin 的灰度掃描值的比值作為整合素α2β1 mRNA 的表達值( 圖1) ; 電泳圖中可見在353bp 和100bp 處有特異性反應條帶，分別是整合素CD44V3 和β?actin 的電泳片段，以整合素CD44V3 和β?actin 的灰度掃描值的比值作為整合素CD44V3mRNA 的表達值( 圖2) 。

2．2 兩組整合素α2β1mRNA 和CD44V3 mRNA 的表達

整合素α2β1mRNA、CD44V3mRNA 的表達值對照組( 0．09±0．03、0．13±0．02) 均低于宮頸鱗癌組( 0．52±0．08、0．65±0．11) ( P＜0．05) 。見圖3。

2．3 兩組整合素α2β1 和CD44V3 的表達

整合素α2β1 和CD44V3 在宮頸鱗癌組織中陽性率均高于對照組( P＜0．05) 。見表1。

圖1 α2β1 mRNA 在宮頸鱗癌中的表達

圖2 CD44V3mRNA 在宮頸鱗癌中的表達

圖3 兩組整合素α2β1mRNA 和CD44V3 mRNA 的表達情況比較

表1 整合素α2β1 和CD44V3 在兩組中的表達(例)

2．4 宮頸鱗癌組整合素α2β1 和CD44V3 與臨床資料關系

整合素α2β1 和CD44V3 的陽性表達與宮頸鱗癌患者的年齡無相關性( P＞0．05) ，但與患者的PTNM 分期、分化程度、是否淋巴結轉移及浸潤深度存在相關性( P 均＜0．05) 。見表2。

2．5 整合素α2β1 與CD44V3 在宮頸鱗癌組織中表達的相關性分析

整合素α2β1 和CD44V3 在宮頸鱗癌組織中的表達呈正相關性( r=0．369，P＜0．05) 。見表3。

表2 宮頸鱗癌組臨床指標與整合素α2β1 和CD44V3 關系比較

表3 整合素α2β1 與CD44V3 在宮頸鱗癌組織中表達的相關性(例)

3 討論

宮頸癌為全球婦女第二大惡性疾病，其發病率和死亡率呈遞增趨勢［8］。目前臨床90%就診宮頸癌患者均處于進展期，即確診時已發生不同程度的局部浸潤、轉移［9］。所以尋找宮頸癌的早期診斷指標和特異性作用途徑抑制轉移或復發，將可能有效阻止并控制腫瘤的侵襲和轉移［10］。宮頸鱗癌的浸潤、轉移是一個多因素、多階段、復雜性的連續發展過程，最終結局是形成轉移瘤［11］。

整合素α2β1 主要是細胞與I 型膠原蛋白作用的功能性受體，α2 亞基與基質成分特異性黏附，β1亞基通過其細胞內片段與細胞骨架連接，參與細胞信號的傳導，調節細胞與膠原蛋白相互作用及腫瘤細胞浸潤、轉移過程中的各個基本環節［12］。通過識別與細胞外基質配體上特殊氨基酸結合，介導細胞與細胞、細胞與ECM 間黏附，導致腫瘤與周圍組織黏附;通過黏附作用以及信號傳導作用，參與炎癥的反應、創傷的愈合、腫瘤的發生與轉移、血栓的形成、免疫應答等生理病理過程。既往研究已表明，整合素α2β1 的黏附作用對維持組織完整和促進細胞遷移等重要作用［13］。整合素α2β1 的信號傳導作用具有雙向性，從而影響基因的表達，細胞的增殖、分化、凋亡等生物學行為。本研究觀察到，宮頸鱗癌組整合素α2β1mRNA 的表達值、陽性率均高于對照組。與相關研究報道，在腫瘤組織及非腫瘤組織中，整合素α2β1 的表達水平存在差異，在胃癌的患者中整合素α2β1、α5 及α6 均呈持續高表達水平一致［14］。

CD44 廣泛存在于細胞表面的一種跨膜糖蛋白，在細胞惡性轉化過程中，其結構和功能均發生顯著變化而影響轉化后腫瘤細胞侵襲轉移行為的粘附分子，在體內分布極廣泛，能與透明質酸等多種配體結合，參與細胞與細胞、細胞與細胞外基質之間的粘附。CD44V 包括CD44V1 ～CD44V10，其中與腫瘤浸潤、轉移較為密切相關的是CD44V3、CD44V6 及CD44V9。CD44V3 能與透明質酸和細胞外基質成分等結合，參與細胞-細胞、細胞-外基質間的粘附過程［15］。劉暉等［16］發現CD44V3 基因蛋白在早期宮頸鱗癌的表達明顯高于良性病變，在正常宮頸組織中未見表達，說明了CD44V3 在早期宮頸鱗癌發生發展中起著重要作用，與宮頸鱗癌的浸潤深度、淋巴結轉移及轉移灶有顯著相關性。Amaral 等［17］研究了黏附因子CD44V3 在正常絨毛、葡萄胎及絨癌中的表達及相關性，結果顯示CD44V3 的過表達促進了葡萄胎、絨癌的浸潤和轉移，作為葡萄胎、絨癌浸潤、轉移及評價預后的生物學指標。

本研究發現，宮頸鱗癌組的CD44V3mRNA 的表達值、陽性率均高于對照組。康穎竹、Martins等［18-19］研究原發胃癌組織發現，CD44v3 的表達與胃癌的臨床分級有關。鑒于此，我們進一步分析了整合素α2β1 和CD44V3 與宮頸鱗癌臨床資料的關系，結果發現，整合素α2β1 和CD44V3 的陽性表達與宮頸鱗癌患者的年齡無明顯相關性，但與宮頸鱗癌患者的PTNM 分期、分化程度、是否淋巴結轉移及浸潤深度均存在明顯相關性; 整合素α2β1 與CD44V3 之間陽性表達率相關性分析顯示，整合素α2β1 和CD44V3 在宮頸鱗癌組織中的表達呈正相關性。表明腫瘤細胞中整合素α2β1 及CD44v3 的高表達與腫瘤的惡化程度有關，與宮頸鱗癌的生物學行為有關。本研究也存在一定局限性，樣本例數較少，且僅為單中心研究，但結果可為以后大樣本多中心研究提供參考。

綜上所述，整合素α2β1 和CD44V3 在宮頸鱗癌組織中呈高表達水平，且其與患者的PTNM 分期、分化程度、是否淋巴結轉移及浸潤深度密切相關，整合素α2β1 和CD44V3 聯合檢測可為宮頸鱗癌患者的診治及預后評估提供參考。