PDGF-BB/BMP-2影響種植體周圍骨形成作用的組織學觀察

周萬琳，李琳琳，劉潤喆，李美華*

(1.吉林大學第二醫院 口腔科，吉林 長春130041；2.吉林大學中日聯誼醫院手術室)

種植體周圍良好的骨結合水平是種植體穩定行使功能及維持長期療效的關鍵，種植體植入后其周圍新骨的形成影響著骨結合水平。機體骨形成是多種骨形成細胞與各類骨生長因子彼此協調作用的過程。作為骨形成的主要功能細胞，成骨細胞通過形成礦化結節以形使成骨功能，礦化結節的形成是骨組織分化成熟的標志。茜素紅染色法通過茜素紅與礦化結節中鈣鹽的顯色反應，從而觀察骨組織鈣鹽沉積情況[1]。Mason染色則通過對骨組織中膠原纖維的顯色以體現骨質的成熟程度。目前，隨著國內外學者對骨生長因子的研究，血小板衍生性生長因子(Platelet-derived growth factor,PDGF)與骨形態發生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)在骨形成過程中的作用的達成了一定的共識[2]，但就PGGF和BMP對種植體周圍骨形成作用的研究與論著仍相對較少。本研究的目的在于利用茜素紅染色法及Masson染色法，觀察PDGF-BB/BMP-2及二者協同對種植體周圍成骨作用的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1研究對象 采用新西蘭白兔24只，無雌雄限制，體重2-2.5 kg，所有實驗對象術區無創傷及感染，由吉林大學白求恩醫學院動物實驗中心統一管理。

1.1.2實驗器械 無菌手術巾、無菌手術手套及手術衣、手術刀、刀柄、眼科剪、骨膜剝離器、縫線、線剪、紗布、注射器、標本瓶。

1.1.3實驗儀器 種植體(北京萊頓公司)、種植機(日本 NSK Surgic XT Plus)、負壓吸引器(YX932D 上海無相儀器儀表有限公司)、顯微鏡(OLYMPUS BX52)、數碼相機(OLYMPUS SP610)。

1.1.4實驗試劑 水合氯醛(中國醫藥上海化學試劑公司)、PDGF-BB及BMP-2(peprotech Company,USA)、麗春紅酸性復紅染液(上海鼎國生物技術有限公司)、茜素紅染液(吉林大學白求恩醫學部病理實驗室)。

1.2 實驗方法

1.2.1動物模型的制備 (1)水合氯醛麻醉家兔，備皮、消毒、鋪單。沿髂骨下緣切開皮膚，逐層分離，暴露雙側髂骨。術中保證低溫生理鹽水降溫，球鉆平整骨面，逐級備洞，植入種植體，嚴密縫合肌層及皮膚。(2)將兔子隨機分為4組，每組6只，分別給予BMP-2、PDGF-BB、BMP-2+PDGF-BB及NaCl陰性對照組，保證給藥途徑及給藥時間一致，術后4組動物食飼相同。

1.2.2標本處理 設置3天、7天、10天為觀察節點，空氣栓塞法處死家兔。種植體及周圍組織于中性福爾馬林固定一周，常規石蠟包埋，切片。

1.2.3Masoon染色 組織切片XY脫蠟水化，Weigert氏鐵蘇木精染核7分鐘，充分水洗，鹽酸酒精分化數秒，返藍，水洗；麗春紅酸性復紅染液染色7分鐘，0.2%HOAc浸洗片刻，1%pma分化4分鐘；0.2%冰醋酸浸洗后，亮綠染色7分鐘；0.2%HOAc浸洗片刻，脫水,XY透明后中性樹膠封固。

1.2.4茜素紅染色 組織切片XY脫蠟水化，PBS滌洗(共3次，每次5 min)；甲醛固定后茜素紅染液染色5 min，快速脫水,XY透明后中性樹膠封固。

2 結果

2.1 Masson染色結果

NaCl對照組，3天時種周圍組織中可見膠原纖維呈綠色，7天、10天時纖維數量增加(圖1)；BMP-2組，3天時可見綠色纖維略少于對照組，7天、10天時可見纖維數量增多(圖2)；PDGF-BB組與對照組相比，3天時較可見多量綠色纖維，隨實驗進行顯示纖維增多，修復能力增強(圖3)；BMP-2+PDGF-BB組與對照組相比，3天時可見綠色纖維略少，7天、10天時則可見膠原纖維數量變多、修復的能力增強，且高于BMP-2組(圖4)。

圖1 NaCl組各時間段纖維修復情況(標尺示50 μm)

圖2 BMP-2組各時間段纖維修復情況(標尺示50 μm)

圖3 PDGF-BB組各時間段纖維修復情況(標尺示50 μm)

2.2 茜素紅染色結果

可見0.9%NaCl陰性對照組的鈣鹽礦化水平隨實驗時間延長無顯著變化；而PDGF-BB組與BMP-2組的鈣鹽沉積水平均隨實驗時間延長而降低，且PDGF-BB組鈣鹽礦化水平降低顯著高于BMP-2組；BMP-2+PDGF-BB組的鈣鹽沉積水平較NaCl對照組略有降低(圖5)。

圖4 BMP-2+PDGF-BB組各時間段纖維修復情況(標尺示50 μm)

圖5 各組的鈣鹽沉積情況情況(標尺示50 μm)

3 討論

種植體周圍骨結合被認為是骨組織對種植體的一種結構性反應，從類骨質形成到最終鈣化為成熟骨組織需要經歷多個階段[3]。成骨細胞、破骨細胞等骨形成細胞是這一過程的主要功能單位，但目前認為機體內各類骨生長因子在調節骨形成的作用體系中占據主導作用。BMPs是一族廣泛分布于骨基質中的低分子酸性糖蛋白多肽，其成員包括BMP-2、BMP-4及BMP-7等。其中BMP-2被認為具備穩定的誘導成骨效果，其機制主要是通過顯著增強細胞內堿性磷酸酶活性，以誘導成骨細胞表型表達，改善I型膠原纖維及骨鈣素的表達水平，從而發揮促骨形成作用[4]。良好的血運是骨組織形成、改建的關鍵，PDGF不僅能夠誘導骨祖細胞分化增殖，還能上調血管內皮生長因子(VEGF)的表達以刺激血管形成，從而發揮促進骨組織再生的作用[5]。

本研究中，茜素紅染色結果表明隨著實驗時間的延長，實驗組較對照組均出現鈣鹽礦化、沉積的減少，考慮可能為種植手術引起周圍骨組織存在小范圍變性壞死，機體激活宿主防御機制，因而存在更多活躍的破骨細胞與多核巨噬細胞，多認為這一現象是成骨細胞為類骨質形成清除障礙，進而加速骨改建進程。從Masson染色結果可以觀察到，在7天、10天時，BMP-2組與PDGF-BB組的白纖維較0.9%NaCl對照組均有增加，且PDGF-BB組綠染的白纖維數量略多于BMP-2組，而茜素紅染色結果則顯示在7天、10天時BMP-2組鈣鹽沉積程度略優于PDGF-BB組，表明可能PDGF-BB在骨形成早期的膠原纖維修復中發揮更優作用，而BMP-2則多作用于稍晚期的骨質礦化、成熟過程。同時可以觀察到，BMP-2+PDGF-BB組在7天、10天時，無論膠原纖維數量還是鈣鹽沉積、礦化程度均優于BMP-2組與PDGF-BB組，表明這兩種生長因子在骨修復、形成早期具備一定的協調、促進效應。

本研究主要通過建立兔髂骨種植模型，從組織病理學角度進一步論證BMP-2、PDGF-BB及其二者協同在種植術后早期的促骨形成作用，以便為臨床種植工作的早期、聯合用藥提供理論支持。

[1]廖乃順，李鉆芳，林如輝，等.比較3種形態學方法觀察成骨細胞礦化結節的應用價值[J].中國組織工程研究,2014,18(33):5266.

[2]羅云綱,曲露露,李美華.骨形態發生蛋白與血小板衍生性生長因子在骨形成中協同作用的研究進展[J].吉林大學學報(醫學版),2013,39(5):1085.

[3]Larsson CW,Thomsen P,Aronsson BO,et al.Bone Response to Surface-Modified Titanium Implants:Studies on the Early Tissue Response to Implants with Different Surface Characteristics[J].International journal of biomaterials,2013,2013(1):412482.

[4]Murray SS,Brochmann Murray EJ,Wang JC,et al.The history and histology of bone morphogenetic protein[J].Histology & Histopathology,2016,31(7):721.

[5]Kanczler JM,Oreffo RO.Osteogenesis and angiogenesis:the potential for engineering bone[J].European Cells & Materials,2008,15(1):100.