銀鯧染色體核型研究

周劍光，張 林，張晨捷，張 濤，彭士明

1.農業部淡水魚類種質監督檢驗測試中心，中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢 430223；2.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090）

銀鯧（Pampus argenteus）俗稱“鏡魚”，隸屬于硬骨魚綱（Osteichthyes），鱸形目（Perciformes），鯧亞目 （Stromateoidei），鯧 科 （Stromateidae）、鯧屬［1］，分布于印度洋、西太平洋，從波斯灣到印尼等海域。為中國近海的常見魚類，東海、南海與黃渤海較多［2-3］。喜歡在淺海巖礁、沙灘水深10～20 m一帶河口處產卵，為海洋洄游性魚類，生活于5～110m海域，幼魚喜躲藏在漂浮物下面，成魚則常與金線魚、鰏魚或對蝦等混游［4-5］。肉食性，食物以水母及浮游動物為主。銀鯧是名貴的海產食用魚類之一，肉質細嫩且刺少，含豐富的蛋白質和脂肪，經濟價值高，是網箱養殖的優良品種。

迄今為止，有關銀鯧的研究主要集中在銀鯧生物學、增養殖及分子克隆等方面，而銀鯧的細胞遺傳學及核型研究尚未見報道。本文采用PHA和秋水仙素腹腔注射、腎細胞直接制片法對銀鯧染色體核型進行了初步研究，以期為該魚的細胞遺傳學特性研究提供數據資料，為探究該物種起源及進化地位及指導遺傳育種生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用魚為東海水產研究所福鼎基地人工繁殖的1齡銀鯧，用于染色體組型分析的8 ind（4雌4雄）銀鯧，體質量15～32 g。實驗用魚從福鼎基地養殖池中取出后，放入直徑2 m的玻璃鋼盆中，為防止銀鯧出現應激反應，玻璃鋼盆中事先加海水至80～100 cm，并加蓋黑色的遮陽布。水溫控制在25℃。

1.2 染色體標本制作

染色體標本制備采用林義浩［6］的體內注射腎細胞法，稍加修改，方法如下：

（1）注射PHA（植物血球凝集素）和秋水仙素。

自實驗魚胸鰭基部注射PHA溶液（0.9%NaCl配制濃度為1 000μg·mL-1），劑量10～15 μg·g-1（魚體質量）；注射20～24 h后胸鰭基部注射秋水仙素溶液（0.9%NaCl配制濃度為1 000 μg·mL-1），劑量5～8μg·g-1（魚體質量）。

（2）剪鰓失血。注射秋水仙素溶液2～4 h后，把實驗魚剪鰓放血5～10 min，魚死前取出頭腎、中腎，用生理鹽水反復洗滌。

（3）制備細胞懸液。將腎組織塊置于裝有少許生理鹽水的小燒杯中，用小剪刀剪碎腎組織，加入生理鹽水，用100目尼龍紗絹過濾。

（4）離心洗滌細胞。將濾液移入離心管1 000 r·min-1離心 8 min。

（5）低滲處理。0.075 mol·L-1KCl低滲處理50～60 min。

（6）固定。在低滲液上加少許固定液（甲醇3：冰醋酸1，以下同），用吸管吹打混勻進行預固定3～4 min，隨后1 000 r·min-1離心8 min（以下時間同）。再重復固定3次，每次20 min。

（7）滴片。將細胞懸浮液滴于預冷載玻片上，隨后將載玻片在酒精燈上過火2～3次，自然干燥后用15%姬姆薩染色30 min，蒸餾水將反面沖洗干凈，自然干燥后鏡檢。

1.3 染色體眾數確定及組型分析

染色體眾數及組型分析參照TAN等［7］的方法進行。稍加修改，方法如下：

（1）染色體計數

選取來自不同個體的100個分散良好的細胞，用顯微鏡（油鏡下）進行觀察、拍照，根據眾數確定二倍體染色體數目。

（2）組型分析

挑選最好的10個數目完整、分散良好、長度適中（正中期）、著絲點清楚、2條單體適度分開、形態清晰的分裂相進行顯微攝影，在相片上對每一條染色體確認著絲點位置，分別測量長臂和短臂，測量數據取其平均值。計算其相對長度、臂比值和著絲點指數，并按LEVAN［8］提出的標準進行配對、分類、排列組型。

2 結果

2.1 銀鯧二倍體染色體數目

統計8 ind銀鯧共100個中期分裂相的結果（表1），其中染色體總數為48的分裂相細胞占全部計數細胞的70%，由此確定銀鯧的二倍體染色體數目為2N＝48（圖1）。對于具有非眾數染色體的分裂相，可能是低滲或滴片過程中少量染色體丟失而造成。

圖1 銀鯧的染色體中期分裂相（×1 000）Fig.1 Themetaphase chromosomes of Pampus argenteus（×1 000）

表1 銀鯧染色體數目的分布Tab.1 Distribution of chromosome numbers of Pampus argenteus

2.2 銀鯧的染色體組型

根據對銀鯧染色體相對長度和臂比的統計結果（表 2），其全部染色體可配成 24對，按LEVAN命名法［8］分成4組，M組（中部著絲點染色體，r＝1.00～1.70）1對；SM組（亞中部著絲點染色體，r＝1.71～3.00）3對；ST組（亞端部著絲點染色體 r＝3.01～7.00）5對；T組（端部著絲點染色體，r＝7.01～∞）15對。按相對長度排列，制成銀鯧染色體組型圖（圖2），核型公式為2N＝2M+6SM+10ST+30T，臂數（NF）＝56。從圖2可以看出，在銀鯧的SM組中，有一對相對本組其它染色體明顯較大的染色體，除此之外，各相鄰兩對染色體之間無明顯差異，大小呈遞減趨勢排列。4組染色體均未發現帶有特殊標志性特征如隨體、次縊痕的染色體，也未發現與性別決定有關的異形性染色體。

表2 銀鯧染色體核型數據Tab.2 Numeral characteristics of the karyotype of Pampus argenteus show ing themean values ofmeasurements from ten bestm itoticmetaphases

圖2 銀鯧染色體組型（標尺 ＝5μm）Fig.2 The karyotype of Pampus argenteus（Bar＝5μm）

3 討論

鱸形目種類繁多，是脊椎動物中種類最多的一個目（約7800種）［9］。目前已報道的鱸形目506種魚類中二倍體的染色體數目及核型顯示出一定的相似性：約60%的種類2N＝48，但在染色體組型和臂數上存在一定差異［10］。本文首次報道了鯧屬魚類染色體，對其核型進行了初步研究。銀鯧M組染色體數為2，SM組染色體數為6，這一結果與舒琥等［11］報道的卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）染色體組型相似，染色體臂數相同，似乎說明這2種魚的親緣關系較近。而與舒琥等［12］報道的紅鰭笛鯛（Lutjanus erythopterus）組型卻存在一定出入，而且染色體臂數也有差異。相同之處是均未發現帶有隨體、次縊痕的染色體。這些現象反映了魚類種間、類群間進化上的趨同性和變異性。但要判定鱸形目內的系統發育及親緣關系，需要借助形態學、生化和分子生物學方法做進一步分析。王金星等［13］利用采自青島和煙臺近海的5種鱸形目魚類所得到的核型均為2N＝48＝48T，與本文及上述報道差異很大，造成這些差異的原因可能是由于鱸形目不同種屬染色體多態現象，但更有可能是由于不同種屬內客觀存在的染色體核型分化所致。

日本學者小島吉雄對800余種已作核型研究的魚類染色體進行研究發現［14］，高位類群的魚類染色體的特點是其數目分布呈收斂狀態較集中，局限在2N＝42～48的范圍內，峰值是2N＝48，M型（包括M和SM染色體）少，A型染色體（包括ST和T染色體）多。銀鯧2N＝48，M型染色體數目為8，A型染色體為40，NF＝56，為典型的高位類群染色體數目。因此，在魚類系統上屬于高位類群，與系統演化上的低位類群如鯉形目、鯰形目大多數種類核型中M型染色體所占比例大（超過 50%）、A型染色體比例小（小于50%）、NF值高的特點相比，有著明顯的區別。

魚類特別是淡水魚類染色體組型的研究，國內外已有大量文獻報道，還有專著出版［15］，但是海水魚類染色體組型的報道則不多見，不到現存海洋魚類的5%［16］，既分散又不系統。在已有核型報道的海洋魚類中，2N＝48的占多數。鯧科魚類染色體研究除本文報道的銀鯧外尚未見其它報道，整個鯧科魚類的核型特征還有待進一步研究。同時，海水魚類細胞遺傳學的系統研究應該進一步加強。

筆者在銀鯧的染色體標本制備過程中，發現銀鯧具有很強的應激反應，往往在操作后短短幾個小時內魚即死亡，給實驗造成了很大困難。經過反復摸索，我們發現采用如下方法可有效減緩銀鯧在實驗過程中的應激反應：1）從暫養池撈魚時，魚全程不能離水，必須帶水操作；2）注射PHA和秋水仙素時，事先用丁香酚麻醉實驗魚；3）注射藥物時，盡量在水面下操作；4）注射藥物后，實驗魚的暫養容器水位保持在80～100cm，上面遮蓋黑色遮陽布避光。這個防應激的方法在同樣具有強應激反應的刀鱭（Coilia ectenes），鰣魚（Tenualosa reevesii）的實驗操作中也可借鑒使用。

［1］ 成慶泰，鄭葆珊.中國魚類系統檢索［M］.北京：科學出版社，1987：140-147.CHENG Q T，ZHENG B S.Systematic Synopsis of Chinese Fishes［M］.Beijing：Science Press，1987：140-147.

［2］ 鄧思明，熊國強，詹鴻禧.中國鯧亞目魚類分類系統的初步研究，魚類學論文集（第二輯）［M］.北京：科學出版社，1981：25-38.DENG SM，XIONGGQ，ZHAN H X.A preliminary study on the blennioid fishes classification system China Stromateoidei，Proceedings of the fish Science（Second Series）［M］.Beijing：Science Press，1981：25-38.

［3］ 成慶泰.鯧科，南海魚類志［M］.北京：科學出版社，1962：759-766.CHENG Q T.Stromateidae，Fish fauna of the South China Sea［M］.Beijing：Science Press，1962：759-766.

［4］ 張春霖.黃渤海魚類調查報告［M］.北京：科學出版社，1955：195-196.ZHANG C L.Yellow Bohai Fish Survey［M］.Beijing：Science Press，1955：195-196.

［5］ 楊文華，成慶泰.鯧科，中國魚類系統檢索［M］.北京：科學出版社，1987：425.YANGW H，CHENG Q T.Stromateidae，Systematic Synopsis of Chinese Fishes［M］.Beijing：Science Press，1987：425.

［6］ 林義浩.快速獲得大量魚類腎細胞中期分裂相的體內 PHA注射法［J］.水產學報，1982，6（3）：201-208.LIN Y H.A PHA injection method in vivo for the rapid obtainment of large numbers of metaphase figures from kidney cells of teleosts［J］.Journal of Fisheries of China，1982，6（3）：201-208.

［7］ TAN X Q，QIN JG，CHEN B N，et al.Karyological analyses on redclaw crayfish Cherax quadricarinatus（Decapoda：Parastacidae）［J］.Aquaculture，2004，234：65-76.

［8］ LEVAN A，TRED K，S A A.Nomencture for centromeric position on chromosomes［J］.Heredita，1964，52（2）：201-220.

［9］ NELSON J.Fishes of the world［M］.（2nd ed.）Canada：John Wiley and Sons，Inc.1984.

［10］ OHNO S.The enormousdiversity ingenome size of fishas a reflection of nature’s extensive experiments with geneduplication［J］.Hereditas，1970，59：169-187.

［11］ 舒 琥，何敏蓮，張海發，等.卵形鯧鰺染色體組型研究［J］.廣州大學學報（自然科學版），2007，6（2）：23-25.SHU H，HE M L，ZHANG H F，et al.Studyon thekaryotyre in the Trachinotus ovatus［J］.Journal of Guangzhou University（Natural science Edition），2007，6（2）：23-25.

［12］ 舒 琥，顧仲堅，王云新，等.紅鰭笛鯛 （Lutjanus erythopterus）的核型研究［J］.廣州大學學報（自然科學版），2003，2（1）：27-29.SHU H，GU Z J，WANG Y X，et al.Studyon the Karyotypein the Lutjanus erythopterus［J］.Journal of Guangzhou University（Natural science Edition），2003，2（1）：27-29.

［13］ 王金星，趙小凡，王相民，等.鯡形目和鱸形目七種魚的核型分析［J］.動物學研究，1994，15（2）：76-79.WANG J X，ZHAO X F，WANG X M，et al.Karyotype analysis for seven species of clupeiform and perciform fishes［J］.Zoological Research，1994，15（2）：76-79.

［14］ SHARMA A K，SHARMA A.Chromosomes in evolution of eukaryotic groups［C］.CRC Press，1983，434（4）：3283-3292.

［15］ 余先覺，周墩，李渝成，等.中國淡水魚類染色體［M］.北京：科學出版社，1989：4-29.YU X J，ZHOU D，LI Y C，et al.Chromosomes of Chinese fresh-water Fishes［M］.Beijing：Science Press，1989：4-29.

［16］ 王梅林，鄭家聲，朱麗巖，等.我國海洋魚類和貝類染色體組型研究進展［J］.青島海洋大學學報，2000，30（2）：277-284.WANGM L，ZHENG JS，ZHU L Y，et al.Advances on karyotype study of marine fish and shellfish in China［J］.Journal of Ocean University of Qingdao，2000，30（2）：277-284.