潘糖標準品的制備與應用可行性評價

李 瑋，董自星，李普均，金 鵬，劉曉光，路福平，王正祥

(1. 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 天津科技大學化工與材料學院，天津 300457)

功能性低聚糖是一類由 2～10個單糖通過α–1，6糖苷鍵結合成的直鏈或支鏈的低聚合度糖類[1]，主要包括低聚異麥芽糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、大豆低聚糖、異麥芽酮糖和低聚龍膽糖等[2].其中低聚異麥芽糖(isomaltooligosaccharides，IMO)主要存在于大米、醬油、日本清酒以及蜂蜜中[3]，它是一種良好的益生元，并可選擇性地刺激腸道益生菌的生長與繁殖，不會打破腸道菌群平衡，有利于宿主機體健康[4]．

近年來，隨著對低聚異麥芽糖研究的不斷深入，無論在科研還是食品工業與醫藥等領域，都需要利用其中起到主要生理活性的關鍵組分(潘糖)的標準品，才能對其進行精確分析與研究．目前，對于功能性低聚糖中的關鍵組分的制備方法有層析法、膜分離法等．盡管層析法的分離效果好，但是需要使用有機溶劑，生產成本高，缺乏市場競爭力[5]．而膜分離法的收率較高，但只可對底物進行逐級分離，無法對特定的單組分進行選擇性地分離，且步驟較為繁瑣[6]．

二級標準物質為特性量值通過與一級標準物質直接比對或用其他準確可靠的分析方法測試而獲得，準確度和均勻性能滿足一般測量的需要，穩定性在半年以上的標準物質[7–8]．由于潘糖的標準品在國內市面不易購買，且從國外訂購的價格昂貴，在很大程度上限制了低聚異麥芽糖的相關研究與應用．本實驗以低聚異麥芽糖粗糖液為研究對象，通過高效液相色譜法對功能性關鍵組分(潘糖)進行分離與純化，最終制得高品質的潘糖標準品，為低聚異麥芽糖的相關研究與應用提供了基礎材料．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品

低聚異麥芽糖粗糖液由實驗室前期制備獲得，其中潘糖含量為47.6,g/L．

1.1.2 試劑與儀器

葡萄糖、麥芽糖和異麥芽糖標準品，北京索萊寶科技有限公司；麥芽三糖、潘糖和異麥芽三糖等標準品，美國 Supelco公司；乙腈，色譜純，Fisher Scientific公司；其他試劑均為國產分析純．

1260,series型蒸發光液相色譜儀、1200,series型示差液相色譜儀，美國 Agilent精密儀器有限公司；PrevailTMCaborhydrate ES 5u分析柱(250,mm×4.6,mm)，美國GRACE精密儀器有限公司．

1.2 低聚異麥芽糖組分的定性分析

1.2.1 樣品處理

稱取 25,g低聚異麥芽糖粗糖液，加水稀釋并定容至 250,mL，配制成 100,mg/mL低聚異麥芽糖溶液作為母液，稀釋50倍后得到2,mg/mL溶液，待用．

1.2.2 低聚異麥芽糖混合標準品的配制

準確稱取葡萄糖、麥芽糖、異麥芽糖、麥芽三糖、潘糖和異麥芽三糖各 4,mg置于 4,mL梯形容量瓶中，并分別加水定容，配制成 1,mg/mL的 6種母液．再分別從每種母液中吸取 150,μL至 1.5,mL EP管中，混勻，制成總質量濃度為1,mg/mL的低聚異麥芽糖混合標準品待用．

1.2.3 低聚異麥芽糖樣品中組分的分析

采用高效液相色譜–蒸發光散射檢測法對低聚異麥芽糖樣品中的組分進行定性分析，以確定各組分的出峰時間及出峰順序．色譜條件：流動相為體積分數70%,乙腈水溶液，流量1,mL/min，柱溫30,℃，蒸發光液相檢測器溫度 90,℃，氣體流量 2.2,L/min，使用GRACE Prevail ES 5u分析柱(250,mm×4.6,mm)進行分析，進樣量為10,μL(自動進樣)．

1.3 潘糖的分離純化

1.3.1 分離樣品濃度的確定

將 1.2.1節中的 100,mg/mL樣品溶液分別稀釋至 30、50、80,mg/mL，采用可回收廢液的高效液相色譜–示差折光檢測法對樣品中的關鍵組分潘糖進行分離純化，通過峰形判斷出達到最佳分離效果的樣品濃度．色譜條件：流動相為體積分數 70%,乙腈水溶液，流量 1,mL/min，柱溫 30,℃，檢測器溫度 35,℃，使用GRACE Prevail ES 5u分析柱(250,mm×4.6,mm)進行分析與分離，進樣量為100,μL(自動進樣)．

1.3.2 潘糖的制備

在上述研究基礎上，根據潘糖在高效液相色譜–示差折光檢測法中的峰形及出峰時間，在保證所得潘糖的純度最高的條件下，對潘糖進行收集，并通過高效液相色譜-蒸發光散射檢測法對所得的每個潘糖流分進行分析鑒定，按照式(1)計算潘糖流分的純度，按照式(2)和式(3)計算其平均純度以及最終得率．

式中：E為潘糖得率，%,；m為收集的所有流分凍干后的平均干質量，mg；P為 5次實驗的潘糖平均純度，%,；ρ為IMO粗糖液質量濃度，mg/mL；V為進樣量，mL；N為進樣次數．

1.4 精密度實驗[9]

從所收集的混合潘糖流分中取 5份樣品，每份1,mL．在相同條件下，按照 1.2.3節的方法采用蒸發光散射檢測器對樣品進行檢測，并計算潘糖峰面積比的相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)．

1.5 重復性實驗

從所收集的潘糖流分中取 1,mL，并制成液相樣品．采用 1.2.3節中高效液相色譜-蒸發光散射檢測法對潘糖流分連續進樣5次，并在同樣條件下進行檢測，根據峰面積的比例計算其RSD值．

1.6 回收率實驗

將潘糖流分每連續收集 50,mL 記為 1組，共收集 5組，每組各取樣 0.75,mL，然后將其分別與 5份0.25,mL、1,mg/mL的葡萄糖標準品溶液混合，使葡萄糖標準品在混合溶液中的終質量濃度為 0.25,mg/mL.采用高效液相色譜–蒸發光散射檢測法對該樣品進行分析，并通過葡萄糖與潘糖在液相圖譜中峰面積的關系以及已知的葡萄糖濃度，計算其中潘糖含量的理論值(mg)．將其余潘糖流分中的乙腈揮干后凍干，稱取所得潘糖的干質量(mg)，并計算回收率、平均回收率及其RSD值．

1.7 穩定性檢驗

隨機抽取 60個樣本(每個樣本為 0.25,mg潘糖固體粉末)于 2～8,℃放置 12個月，每月抽取 5個樣品，每個樣本檢測 2次，與初始數據進行比較，評價其在冷藏(2～8,℃)保存條件下的穩定性．對數據進行統計學分析，以P＜0.05為有統計學意義．

2 結果與討論

2.1 蒸發光散射檢測法定性分析樣品中的組分

采用蒸發光散射檢測法對 2,mg/mL的低聚異麥芽糖溶液中的組分進行分析，結果如圖1所示．

由于色譜柱為正相柱，低聚異麥芽糖產品中各組分按標準品圖譜中的出峰時間從左至右依次為麥芽糖、異麥芽糖、麥芽三糖、潘糖和異麥芽三糖，標準品和樣品中的潘糖出峰時間分別為 15.958,min和16.092,min，這為后續通過示差折光檢測法對潘糖組分進行分離純化提供了依據．

圖1 蒸發光散射檢測法分析2,mg/mL低聚異麥芽糖產品組分的液相圖譜Fig. 1 The liquid chromatogram of 2,mg/mL IMO analyzed by HPLC-ELSD

2.2 關鍵組分潘糖的分離

根據高效液相色譜–蒸發光散射檢測法中潘糖的出峰順序和出峰時間，采用高效液相色譜-示差折光檢測法分別對 3種不同濃度的低聚異麥芽糖產品中的潘糖進行分離純化，以確定最佳分離濃度，其結果如圖2所示．

圖2 樣品濃度對低聚異麥芽糖中潘糖的分離效果的影響Fig. 2 Effects of concentration on the separation of panose from IMO samples

由潘糖與麥芽三糖、異麥芽三糖之間的分離度可 知，當樣品質量濃度為 80,mg/mL時，潘糖與麥芽三糖和異麥芽三糖的分離效果最差．樣品質量濃度為30,mg/mL時，潘糖的分離效果較好．而當 IMO溶液的質量濃度為 50,mg/mL時，潘糖與麥芽三糖和異麥芽三糖的分離效果最好(圖 2(b))．此外，在該濃度下，通過示差折光檢測法對潘糖進行分離純化時，潘糖的出峰時間為14.564,min．

在保證得率最大的前提下，從潘糖出峰開始對潘糖組分進行收集直到出峰結束，通過蒸發光散射檢測法對其鑒定，結果如圖 3(a)所示．根據峰面積的比例可知，潘糖的純度為 69.36%,，得率為 34.68%,．應繼續進行潘糖收集方法的優化．

圖3 蒸發光散射檢測法分析純化得到的潘糖流分Fig. 3 Analysis of the purified panose using HPLC-RID

由于樣品隨流動相經過檢測器對于流分收集會有時間上的延遲，所以按全峰所收集的流分中潘糖純度較低，增加了分離純化的難度，故將收集的時間縮短，增加收集次數(共收集 8次)．為了保證所收集的潘糖的純度最大，從峰頂收集至峰尾，并將所得潘糖流分經過蒸發光散射檢測法進行鑒定，確定其純度，結果如圖3(b)所示．所收集的潘糖流分中，除大部分為潘糖外，還有少部分麥芽三糖雜質．根據峰面積的比例關系可知潘糖的純度為98.43%，得率為49.22%.且潘糖的出峰時間為16.053,min，與圖1(a)中潘糖標準品的出峰時間(15.958,min)的差值的比值為0.6%,，小于 5%,，可以確定此收集方法所得的流分為潘糖．經過多次實驗，所分離得到的潘糖純品的純度為(98.43±0.25)%,，略高于阿拉丁試劑和梯希愛(上海)化成工業發展有限公司等銷售的潘糖(CAS號：33401-87-5)的純度(98%)．

2.3 精密度實驗

為了驗證所得潘糖流分純度的穩定性，在相同條件下，采用蒸發光散射檢測法對5份潘糖樣品進行檢測．5份樣品的峰面積及其百分比見表 1．通過計算可知，其RSD為 0.25%,，符合 2015年版中華人民共和國藥典(精密度實驗中 RSD 應小于 3.0%,)的相關規定[10]，精密度較好．

表1 精密度實驗的結果Tab. 1 Results of precision experiment

2.4 重復性實驗

重復性實驗的結果見表 2，計算獲得 RSD為0.27%，符合 2015年版中華人民共和國藥典(HPLC系統適用性要求中連續進樣5次峰面積 RSD應小于2.0%)的規定[10]，重復性較好．

表2 重復性實驗的結果Tab. 2 Results of repetitive experiment

2.5 回收率實驗

對所制備5組潘糖流分的回收率進行測定，結果見表3．最終算得潘糖的平均回收率為(96.20±0.73)%，RSD為0.73%,，符合2015年版中華人民共和國藥典中關于回收率的RSD應小于1%,的要求[10]．

表3 回收率實驗的結果Tab. 3 Results of recovery ratio experiment

2.6 穩定性檢驗結果

在2～8,℃保存12個月的不同時間點，每次抽取5個潘糖樣本，每個樣本檢測 2次，評價其穩定性．穩定性檢驗的結果表明，潘糖在 2～8,℃可穩定至少12個月(圖 4，P＞0.05)．

圖4 潘糖的穩定性檢驗Fig. 4 Evaluation of the stability of panose

隨著人們對功能性低聚糖的開發與應用有了更深層次、更高精確度的需求，功能性低聚糖中關鍵組分的分離與純化，無疑是低聚糖檢測最關鍵的部分[11].本文通過示差折光檢測法對低聚異麥芽糖中的關鍵組分潘糖進行了分離純化，實現了潘糖標準品的制備．與于德水等[12]使用的結晶法相比，本方法具有周期短、簡便易行、精確性好、靈敏度高以及樣品耗費低等優點．并且所得關鍵組分的純品亦可有針對性地運用到食品和保健品行業[13]．此外，潘糖單組分的純度與均勻性可滿足一般測量的需要，這符合我國標準物質管理委員會關于二級標準物質的規定[7]．

3 結 論

本文通過蒸發光散射檢測法對低聚異麥芽糖樣品中的組分進行了初步的定性分析，接著利用示差折光檢測法對潘糖進行了分離純化，實現了低聚異麥芽糖中潘糖組分標準品的制備．所分離得到的潘糖純品的純度為(98.43±0.25)%,；精密度實驗和重復性實驗中的 RSD 分別為 0.25%,和 0.27%,；平均回收率為(96.20±0.73)%,；并且在 2～8,℃可穩定保存至少 12個月，符合 2015年版中華人民共和國藥典以及國家標準物質管理委員會關于二級標準物質的規定．因此，本研究中所制得的潘糖組分可作為二級標準品使用，也為低聚異麥芽糖的進一步開發和功能性探索奠定了基礎．

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