不同分子量段巢脾多糖理化性質及其抗氧化活性分析

殷玲，吉挺，戰旭梅，李冠華

（1.江蘇農牧科技職業學院，江蘇泰州225300；2.揚州大學動物科技學院，江蘇揚州225009）

中國是世界第一養蜂大國，養蜂生產淘汰下來的巢脾數量相當可觀。蜜蜂世代在巢脾內棲息和繁衍，老巢脾內殘留大量蜂蜜、花粉、蜂王漿、蜂膠、幼蟲繭衣及其分泌物，研究表明蜜蜂巢脾含有大量的生物活性成分，如多糖、有機酸、生物堿、鞣質以及苷類等[1-3]。蜜蜂巢脾具有抑菌殺菌，殺蟲攻毒，祛風鎮痛，降血壓，降血脂，抗氧化等多種生物學及藥理學價值[4-6]。但巢脾常被用來提取蜂蠟，而其它活性物質卻被丟棄，造成了極大的資源浪費。近年來，隨著人們對天然多糖研究的深入，天然多糖所具有的調節人體免疫、抗氧化、抗腫瘤、降低固醇等各種生理功能逐漸為人們所重視[7-9]，多糖已經開始在食品、功能性保健品、藥物等領域進行開發應用[10-11]。蜜蜂巢脾多糖（下文簡稱巢脾多糖）是蜜蜂巢脾中的主要功效成分，有著重要的開發價值和廣闊的應用空間，而目前對于蜂巢多糖的生物活性研究仍處于空白。多糖的生物學活性受到多糖的分子量，結構，及其理化性質如黏度、溶解度等因素的影響[12-13]。本試驗采用超濾法對巢脾多糖進行分級分離，獲得分子量為 4 kDa~10 kDa（HCP-1）、10 kDa~50 kDa（HCP-2）、50 kDa~100 kDa（HCP-3），大 于100 kDa（HCP-4）4個不同分子量段的巢脾多糖，并對4個分子量段巢脾多糖的理化性質和抗氧化活性進行分析，以期為巢脾多糖的構效關系研究及活性成分的有效開發利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西方蜜蜂老巢脾（使用3年以上）。

氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、咔唑、溴化鉀、乙腈、甲醇、磷酸二氫鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；三氟乙酸（TFA）、1-苯基-3-甲基-5-吡啉酮（PMP）、單糖標準品均為（色譜純）：上海源葉生物科技有限公司。

抗超氧陰離子測定試劑盒、羥自由基測定試劑盒、總抗氧化測定試劑盒：南京建成生物制藥研究所。

1.2 儀器與設備

MSC300 超濾杯、截留分子量為 4、10、50、100 kDa的超濾膜：上海魔速科學器材有限公司；4種超濾膜紫外可見分光光度計T6、雙光束紫外可見分光光度TU-1901：北京普析通用儀器有限公司；高效液相色譜1260：德國安捷倫公司；顯微紅外光譜儀670：美國Varian公司；全波長掃描式多功能讀數儀：美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 蜜蜂巢脾多糖的提取及分級

粉碎的蜜蜂巢脾→按1∶15（g/mL）加入蒸餾水→50℃水浴鍋水浴90 min→120目紗布過濾→重復3次→濃縮至原溶液的1/4→冷卻離心→1∶4無水乙醇→4℃靜置過夜→取沉淀離心→蜜蜂巢脾粗多糖→去色素→去蛋白→蜜蜂巢脾多糖→依次使用截留分子量的為4、10、50、100 kDa的超濾膜超濾→獲得分子量為 4 kDa~10 kDa（HCP-1）、10 kDa~50 kDa（HCP-2）、50 kDa~100 kDa（HCP-3），大于 100 kDa（HCP-4）的多糖樣品。

1.3.2 巢脾多糖基本理化性質的測定

1.3.2.1 基本組成測定

分別采用費林試劑反應及硫酸-苯酚法測定蜜蜂巢脾多糖中還原糖及總糖含量；利用三氯化鐵反應及碘-碘化鉀反應分別檢測多羥基酚類物質及淀粉；考馬斯亮藍法檢測蛋白質含量；硫酸-咔唑法檢測糖醛酸含量；pH計在室溫下測其pH值；不同極性溶液檢測其溶解性。

液相色譜法測定巢脾多糖的單糖組成。液相色譜條件[13]為色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，250 mm×4.6 mm×5 μm；流動相：0.1 mol/L 磷酸二氫鉀（pH6.7）緩沖液-乙腈（0~18 min體積比為82∶18，18 min~40 min體積比為83∶17）；柱溫：25℃；檢測波長：250 nm；流速：1 mL/min；進樣體積：20 μL。檢測器：DAD。

1.3.2.2 光譜分析

巢脾多糖樣品（0.05 mg/mL）置于紫外可見分光光度計中190 nm~380 nm波長處進行掃描。巢脾多糖（充分干燥粉末）少許，加入少許溴化鉀晶體，在紅外燈照射下于瑪瑙研缽中輕輕研磨至極細，用壓片機壓制成透明薄片，經顯微紅外光譜儀400 cm-1~4 000 cm-1中紅外區掃描。

1.3.3 體外抗氧化能力檢測

按照試劑盒方法測定各分子量段的巢脾多糖體外抑制羥自由基能力、抗超氧陰離子能力及總抗氧化能力。

2 結果與分析

2.1 不同分子量段蜜蜂巢脾多糖理化性質鑒定

2.1.1 不同分子量段蜜蜂巢脾多糖的單糖基本組成

對不同分子量巢脾多糖的蛋白質含量、總糖含量、糖醛酸含量、還原糖含量及pH值進行分析，結果見表1。

由表1可知，經計算巢脾多糖中總糖含量為75 g/100 g左右，糖醛酸含量在0.2 g/100 g左右，各分子量段差異不大。蛋白質含量隨著分子量的增大而增高，這是由于多糖的糖鏈常與肽鏈結合，形成糖肽或糖蛋白，增加了多糖的分子量。而還原糖含量則隨著分子量的增大而減小，說明多次超濾，有效地降低了單雙糖的含量。各分子量段巢脾多糖pH值在7左右，屬于中性多糖。多糖溶于水是其發揮生物學活性的首要條件[12]，定性檢測結果顯示，各級別HCP不含淀粉及多酚類物質，可溶于水、稀酸及稀堿，不溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有機溶液。

本試驗以12種常見單糖作標準品，采用柱前衍生化法對蜜蜂巢脾多糖中的單糖組成進行分析。分析結果如表2所示。

表2 不同分子量段巢脾多糖的單糖組成Table 2 Monosaccharide composition of comb polysaccharide with different molecular weights

由表2可知，不同級別多糖均含有甘露糖、葡萄糖醛酸，各分子量段單糖組成及含量差異較大。HCP-1中含鼠李糖、半乳糖醛酸、氨基半乳糖；HCP-2中含氨基葡萄糖、核糖；HCP-3中含核糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖；HCP-4中含核糖、鼠李糖、氨基半乳糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖。本研究中各HCP的單糖組成差異較大，有研究結果顯示多糖生物學活性受其主鏈糖單元組成影響較大[14-15]，提示各分子量段生物活性差異可能與其單糖組成有關。

2.1.2 光譜分析

紫外光譜掃描結果見圖1。

圖1 不同分子量段巢脾多糖的紫外光譜圖Fig.1 UV absorption spectra of comb polysaccharide with different molecular weights

由圖1可知，各分子量段巢脾多糖峰型特征一致，在波長380 nm~190 nm中，各分子量未出現明顯的特征吸收峰，吸光度值隨著波長的縮短而增大，直至190 nm處出現最大吸收值。

紅外光譜是研究聚合物結構和化學鍵，表征或鑒別不同化合物的常用手段之一，具有高度的特征性，是一種有效研究分子官能團特征的手段。各分子量段巢脾多糖的紅外光譜圖如圖2所示。

圖2結果顯示各分子量段巢脾多糖皆具有典型的多糖特征吸收峰（3 387.3、2 934.4、1 413.4、772.3 cm-1），且峰型基本一致[16]。在3387.3cm-1處出現的寬峰為分子間和分子內羥基（O-H）伸縮振動特征峰[17]，2 934.4 cm-1處吸峰收為糖鏈中飽和甲基或亞甲基（C-H）伸縮振動峰[18]，1 413.4 cm-1處吸收峰為N-H的變角振動峰，772.3 cm-1處吸收峰為C-X伸縮振動[19]。此外，1 630.2 cm-1處吸峰收為C=O伸縮振動峰，表明該多糖為糖蛋白綴合物[20-21]。而在1700 cm-1～1 775 cm-1范圍內無明顯吸收峰，表明樣品中不含羧基，即該多糖是一種中性糖[18]，這與pH值檢測結果一致。1 075.9 cm-1處吸收峰可能是吡喃糖環的特征吸收峰[19]，891.3 cm-1處有吸收說明該多糖存在β型吡喃糖苷[17]。由于多糖的結構具有一定的相似性，所以多糖的紅外光譜具有某些相同的特征吸收峰。通過對一些特征峰的分析，可對多糖結構中是否含有這些殘基或大致結構類型進行判斷。試驗結果顯示，各分子量段紅外光譜特征吸收峰基本一致，說明其所含殘基大致相同。

圖2 巢脾多糖的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of comb polysaccharide with different molecular weights

2.2 不同分子量段蜜蜂巢脾多糖的抗氧化活性

2.2.1 不同分子量段巢脾多糖對羥自由基的清除作用

不同分子量段巢脾多糖對羥自由基的清除能力如圖3所示。

由圖3可知，在所選濃度范圍內，所有分子量段的巢脾多糖清除能力隨濃度的增大而增大，在濃度為30 mg/mL時，HCP-4對羥自由基的清除能力達到最高80.80 U/mL。總體而言，各分子量段巢脾多糖對羥自由基都具有較強的清除能力，其中HCP-3及HCP-4效果最好。

圖3 不同分子量巢脾多糖對羥自由基的清除能力Fig.3 Scavenging activities of comb polysaccharide with different molecular weights against alkyl free radicals

2.2.2 不同分子量段巢脾多糖對超氧自由基的清除作用

不同分子量段巢脾多糖對超氧自由基的清除能力如圖4所示。

圖4 不同分子量巢脾多糖對超氧自由基的清除能力Fig.4 Scavenging activities of comb polysaccharide with different molecular weights against hydroxyl free radicals

由圖4可知，各分子量段巢脾多糖均具有清除超氧自由基的能力，在一定范圍內，抑制率與多糖濃度呈量效關系。其中HCP-3及HCP-4對超氧自由基的清除能力優于HCP-1及HCP-2，在濃度為50 mg/mL時，HCP-4對羥自由基的清除能力達到最高63.40 U/mL。

2.2.3 不同分子量段巢脾多糖對總抗氧化能力的測定

不同分子量段巢脾多糖總抗氧化能力（TOA）如圖5所示。

圖5 不同分子量巢脾多糖對總抗氧化能力的測定Fig.5 Total antioxidant capacity of comb polysaccharide with different molecular weights

由圖5可知，在一定濃度范圍內，各級分子量多糖TOA與多糖濃度呈量效關系。當多糖濃度達到40mg/mL時，各級分子量多糖的TOA達到最高，其中HCP-4總抗氧化能力最高為486.23 U/mL，且HCP-4總抗氧化能力明顯高于其它分子量多糖。

3 結論

本試驗采用4個不同截留分子量的超濾膜，對巢脾多糖進行分級分離，獲得分子量為4 kDa~10 kDa（HCP-1）、10 kDa~50 kDa（HCP-2）、50 kDa~100 kDa（HCP-3），大于 100 kDa（HCP-4）4 個不同分子量段的巢脾多糖，并對不同分子量段巢脾多糖的理化性質和抗氧化活性進行分析。結果顯示巢脾多糖中總糖含量為75 g/100 g左右，糖醛酸含量在0.2 g/100 g左右，各分子量段差異不大。蛋白質含量隨著分子量的增大而增高，還原糖含量則隨著分子量的增大而減小。各分子量段巢脾多糖pH值在7左右，屬于中性多糖。定性檢測結果顯示，各分子量段多糖不含淀粉及多酚類物質，可溶于水、稀酸及稀堿，不溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有機溶液。各分子量段巢脾多糖紫外及紅外光譜特征相似，而單糖組成及含量差異較大，HCP-3及HCP-4中單糖種類及含量相比于HCP-1及HCP-2都較為豐富。體外抗氧化活性分析結果顯示，在一定濃度范圍內，各分子量段多糖對超氧自由基、羥自由基清除能力及總抗氧化能力與多糖濃度呈明顯的量效關系，總體而言，HCP-4的抗氧化活性最強，這是否與HCP-4的單糖組成豐富相關，還需要進一步探討。本研究為巢脾多糖的構效關系研究及活性成分的有效開發利用提供了理論基礎。

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